汉黄芩素提高人CD3AK 细胞杀伤肝癌细胞的实验研究和机理探讨①

李晓楠 姬会春 周 燏 郑 璐 刘军权 朱月华

(徐州医学院附属医院西院 中煤五公司职工医院，徐州 221006)

汉黄芩素是唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的主要活性化合物之一。许多研究发现其具有显著的抗炎、抗病毒、神经保护和抗肿瘤作用。用CD3 单克隆抗体和多种细胞因子联合诱导培养的人外周血单个核细胞(CD3AK 细胞)是已知最有效的抗肿瘤免疫效应细胞之一。刘军权等［1］报道，用CD3 单抗和多细胞因子联合活化的杀伤细胞对SGC-7901、SW-1990 和SW-1116 细胞杀伤活性明显高于常规的细胞因子诱导杀伤细胞(CIK 细胞)。本研究在预试验中发现，汉黄芩素不仅对肝癌细胞有直接抑制作用，还能提高CD3AK细胞增殖和增强杀伤肝癌细胞株SMMC-7721 的功能。但汉黄芩素对提高CD3AK 细胞增殖和功能的具体机制尚不清楚。因此，本研究拟用不同浓度的汉黄芩素对人CD3AK 细胞和肝癌细胞株进行体外诱导试验，以研究其可能机制。根据实验结果也可为汉黄芩素的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 汉黄芩素(BetA)(美国Sigma 公司，纯度﹥99%);人肝癌细胞株SMMC-7721(上海细胞生物研究所);四甲基偶氮唑蓝(Methlthiazolyl tetrazolium，MTT)和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)(Sigma 公司);淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所);IL-1α、IL-2、IL-18(厦门特宝生物公司);IL-15 和IL-21(购自R＆D 公司);CD3 单抗(上海免疫研究所);CD28 单抗(苏州大学生物技术研究所);IFN-γ 购于Abender 公司;胰蛋白酶、RPMI1640、小牛血清(均购自Gibco 公司);人AB 血清(徐州市血站);PerCP-Cy5.5 标记的CD3、FITC 标记的CD56、PE 标记的穿孔素(Pore-forming protein，PFP)、颗粒酶B (Granzyme B，GrB)、APC 标记的CD107a (联科生物有限公司);兔抗人ERK1/2 单克隆抗体(购自美国CST 公司);乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社);垂直式电泳装置、电转移槽(北京希亚克技术有限公司);BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所);ST-360 酶标仪(上海科华实验系统有限公司);Encore 自动生化分析仪(北京希亚克技术有限公司;荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon 公司);流式细胞仪(美国BD公司);流式细胞仪分析软件CellQuest，每个标本分析细胞数≥1×104。

1.2 实验方法

1.2.1 人CD3AK 细胞的培养和鉴定 取健康供者外周血10 ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(1 500 r/min，离心15 min)，取单个核细胞层用生理盐水洗涤3 次(1 800 r/min，8 min/次)，用RPMI 1640 培养液调整细胞密度为5×108L-1，接种于细胞培养瓶中，每瓶15 ml，同时加入相应的细胞因子(IL-1α 10 μg/L、rhIL-2 5×104U/L、CD3 mAb 1 mg/L、IL-15 20 μg/L、IL-18 10 μg/L、IL-21 10 μg/L 和CD28 mAb 10 mg/L)，置37℃、50 ml/L CO2环境培养，每2 d 半量换培养基(含相应的细胞因子)1 次，并调整细胞密度为5×108L-1。收集培养7 d 的细胞进行细胞表面标志检测及相关实验。

1.2.2 不同浓度的汉黄芩素对CD3AK 细胞增殖的测定 将培养成功的CD3AK 细胞配成2×107L-1细胞悬液加入96 孔板，每孔180 μl，每组设5 个复孔，同时设阴性对照组，实验组分别加入不同浓度的汉黄芩素(浓度分别至0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，于培养箱中培养24、48、72 h;在培养结束前4 h 每孔加入CCK-8 10 μl，继续分别培养2、4、6 h 后在酶标仪450 nm 处检测各孔吸光值(OD)，并记录结果。

1.2.3 汉黄芩素对肝癌细胞株生长的影响 取对数生长期的SMMC-7721 细胞配成3×107L-1的细胞悬液加入96 孔板，每孔180 μl，每组设5 个复孔，同时设阴性对照组;将培养板放入37℃、50 ml/L 培养箱培养24 h 后，实验组分别加入不同浓度的汉黄芩素(浓度分别至0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，于培养箱中培养72 h;在培养结束前4 h 加入MTT 20 μl/孔，继续培养4 h 后弃去上清，加入DMSO 150 μl，使甲瓒完全溶解，于酶标仪495 nm 处检测各孔吸光值(OD)记录结果。细胞抑制率IR(%)=(对照OD 值)-(实验OD 值)/(对照OD)×100%。相同实验重复3 次，取平均值。

1.2.4 FCM 检测汉黄芩素作用后的CD3AK 细胞中GrB、IFN-γ、PFP、CD107a 的表达 根据用CCK-8方法对汉黄芩素作用CD3AK 细胞的实验结果，选择终浓度分别为0.2、0.8、3.1、12.5、50 mg/L 的汉黄芩素进行CD3AK 细胞诱导实验。收集经药物诱导48 h 和CD3AK 细胞，洗涤1 次后将细胞调整密度为1×1010L-1，取其100 μl 细胞悬液加入PerCPCy5.5 标记的CD3 抗体20 μl，室温避光孵育30 min，PBS 洗涤，加入100 μl 破膜剂A，室温避光孵育15 min，PBS 洗涤，加入100 μl 破膜剂B，同时分别在试管中加入anti-GrB-PE 和anti-PFP-PE 各5 μl，设置同型对照抗体管，共同孵育15 min，PBS 洗涤后，加入PBS 500 μl，流式细胞仪检测GrB 和PFP百分数;另取经汉黄芩素作用后的CD3AK 细胞，调整细胞数至1×1010L-1，取100 μl 细胞悬液，加入PerCP-Cy5.5 标记的CD3 抗体20 μl，室温避光孵育30 min，PBS 洗涤，加入APC 标记的鼠抗人anti-CD107a 5 μl，同时设同型对照抗体管，流式细胞仪术测定CD3AK 细胞中CD107a 的百分数。

1.2.5 检测汉黄芩素作用后的CD3AK 细胞对肝癌细胞株SMMC-7721 杀伤活性 按刘军权等［2］方法，取经不同浓度汉黄芩素诱导48 h 后的CD3AK 细胞配成2×109L-1，取对数生长期靶细胞SMMC-7721配成2×108L-1的细胞悬液，用RPMI1640 培养基洗涤3 遍，将效靶细胞按10 ∶1比例混合，以500 r/min离心5 min，置37℃、50 ml/L CO2孵箱中孵育6 h后，轻轻混匀细胞，再以1 500 r/min 离心10 min。收集上清液在全自动生化分析仪(Olympus AU1000)340 nm 波长下测定光密度(A)。相同实验重复3 次，取平均值。杀伤活性(%)=(A 实验组-A 效应细胞自然释放组)/(A 靶细胞最大释放组-A 靶细胞自然释放组)×100%。

1.2.6 Western blot 检测汉黄芩素作用前后CD3AK细胞p-ERK 表达的变化 取培养7 d 的CD3AK 细胞，配成5×108L-1细胞悬液，分别接种于6 孔板，3 ml/孔，加入汉黄芩素(终浓度分别至50、12.5、3.2、0.8 和0.2 mg/L)，同时设置不加汉黄芩素对照组。继续培养48 h 后，加细胞裂解液500 μl 裂解细胞，提取蛋白，Forlin 检测蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭2 h，一抗孵育:加入新鲜配制的1 ∶500 稀释鼠抗人p-ERK1/2 抗体，置于4℃冰箱过夜;二抗孵育:加入1 ∶1 000 稀释的碱性磷酸酶标记马抗鼠IgG，将滤膜浸入NBT/BCIP 显色液，终止反应后取出条带晾干，ODSEEY 上机扫描。用Image J 图像分析软件进行分析。

1.2.7 侵袭实验(Invasion assay) 按实验设计分为对照组和50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 汉黄芩干预组。取对数生长期的SMMC-7721 细胞，调整密度为1.0×108L-1，吸取200 μl 细胞悬液加入24 孔侵袭小室(transwell chambers)的上室，下室缓慢加入500 μl 培养基，37℃、50 ml/L CO2培养箱中孵育48 h，取出小室用RPMI1640 洗涤3 次，用棉球擦去上室面的细胞，下室面用无水乙醇固定10 min，PBS 漂洗后用0.1%的结晶紫染色10 min，PBS 漂洗3 次。显微镜下计数穿过transwell 小孔的细胞，观察5 个视野并拍照，实验重复3 次。侵袭抑制率(IR)=(1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100%。

1.2.8 划痕愈合实验(Wound healing assay) 将对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养，加入6 孔细胞培养板中，当SMMC-7721 细胞生长融合达到90% 时，用200 μl 的移液器枪头，在培养板每孔中央的纵轴方向划痕，吸去原培养基，用RPMI1640 培养基洗2次，去除划痕区的漂浮细胞。每孔加入10%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养5 ml，然后分别加入终浓度为50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 汉黄芩素，37℃、50 ml/L CO2恒温培养箱中孵育，在培养0、24、48 h 时分别于倒置显微镜下观察细胞融合生长情况并拍照，每组设3 个复孔，实验重复3 次。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0 软件进行数据处理，数据均以±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物诱导前后CD3AK 细胞形态学观察及纯度检测 CD3AK 细胞经不同浓度汉黄芩素诱导后，显微镜下可见CD3AK 细胞体积增大，成圆形或椭圆形，胞膜光滑，细胞数量增多，部分形成集落，FCM检测此浓度下CD3AK 细胞表型，显示CD3+CD56+比率达30.5%，结果见图1、2。

2.2 汉黄芩素对CD3AK 细胞增殖的影响 CD3AK 细胞经不同浓度汉黄芩素诱导后，其细胞增殖率出现明显变化，在0.025～25 mg/L 浓度范围内，汉黄芩素能明显促进CD3AK 细胞增殖，汉黄芩素浓度为3.2 mg/L 时细胞增殖率最明显，与对照组(0 mg/L)比较有统计学差异(P＜0.05)，结果见图3。

2.3 MTT 法检测汉黄芩素对SMMC-7721 细胞生长的影响 经浓度为0.8～100 mg/L 汉黄芩素作用72 h 后的SMMC-7721 细胞与对照组比较均有明显的抑制作用，两者比较有统计学差异(P＜0.05)，结果见图4。

图1 培养前后显微镜下CD3AK 细胞形态(×400)Fig.1 Morphology of human CD3AK cells under microscope after Wogonin induced 48 h (×400)

图2 PBMC 培养前后CD3AK 细胞表型分析Fig.2 Phenotype analysis of human CD3AK cells after Wogonin-induced

图3 汉黄岑素对CD3AK 细胞生长的影响Fig.3 Effect of Wogonin on proliferation of CD3AK cells

图4 不同浓度汉黄岑素对SMMC-7721 细胞生长的影响Fig.4 Effect of Wogonin on proliferation of SMMC-7721

2.4 汉黄芩素对CD3AK 细胞颗粒酶B、穿孔素和CD107a 表达的影响 经0.4～50 mg/L 汉黄芩素作用48 h 后的CD3AK 细胞，其颗粒酶B、穿孔素及CD107a 的表达均有所上调。当汉黄芩素浓度为3.2 mg/L 时，颗粒酶B、穿孔素及CD107a 分别为76.9%、30.5%和83.6%，显著高于对照组(分别为65.4%、25.1%和75.3%)，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1、图5。

2.5 汉黄芩素对CD3AK 细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞活性的影响 实验结果显示，浓度为0.2～6.2 mg/L 汉黄芩素作用48 h 后的CD3AK 细胞，对SMMC-7721 细胞的杀伤活性显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。在3.2 mg/L 时杀伤活性达最高(60.4%)，与对照组(汉黄芩素为0 mg/L)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。汉黄芩素浓度高于6.2 mg/L 时，杀伤活性随浓度增高逐渐降低，当浓度为25 mg/L 时，可抑制CD3AK 细胞对SMMC-7721 细胞的杀伤活性(P＜0.05)，结果见图6。

表1 汉黄芩素对CD3AK 细胞颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达的影响Tab.1 Effect of Wogonin on expression of GrB，PFP and CD107a

图5 3.2 mg/L 汉黄芩素诱导后CD3AK 细胞颗粒酶、穿孔素和CD107a 的表达Fig.5 Expression of perforin，GrB and CD107a of CD3AK cells induced by 3.2 mg/L Wogonin

2.6 汉黄芩素对CD3AK 细胞ERK1/2 表达的影响不同浓度汉黄芩素作用48 h 后的CD3AK 细胞其ERK1/2 蛋白表达较对照组均有所上调，浓度在12.5～0.8 mg/L 时，ERK1/2 蛋白表达均高于对照组，以3.2 mg/L 最明显，差异有统计学意义(P ＜0.05)，结果见图7、8。

2.7 划痕愈合实验(Wound healing assay) 经浓度为50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 汉黄芩素诱导48 h后，肝癌细胞SMMC-7721 的融合率以3.2 mg/L 时最低，与对照组比较有统计学意义。其他汉黄芩浓度组诱导的SMMC-7721 融合率也较对照组低。结果见图9。

2.8 侵袭实验(Invasion assay) 经浓度为50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 汉黄芩素诱导48 h 后，肝癌细胞SMMC-7721 通过transwell 小孔细胞数以汉黄芩素浓度为12.5 mg/L 时最低;浓度在12.5～0.8 mg/L 时，细胞穿过率也低于对照组，各汉黄芩素诱导组SMMC-7721 细胞穿过率与对照组比较均有统计学差异，药物诱导的各组侵袭抑制率均低于对照组。结果见图10。

图6 经汉黄芩素诱导后的CD3AK 细胞对SMMC-7721杀伤活性Fig.6 Cytotoxicity of CD3AK cells treated by Wogonin

图7 汉黄芩素诱导48 h 后CD3AK 细胞ERK1/2 的表达Fig.7 Expression of ERK1/2 induced by Wogonin for 48 h

图8 汉黄芩素诱导48 h 后CD3AK 细胞ERK1/2 的表达Fig.8 Expression of ERK1/2 after treated by Wogonin for 48 h

图9 3.2 mg/L 汉黄芩素诱导后SMMC-7721 细胞融合结果比较Fig.9 Wound healing assay result of SMMC-7721 after treated by 3.2 mg/L Wogonin

图10 12.5 mg/L 汉黄芩素诱导后SMMC-7721 细胞穿过率结果比较Fig.10 Invasion assay result of SMMC-7721 treated by 12.5 mg/L Wogonin

3 讨论

肝癌是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的恶性肿瘤，是恶性程度及转移率很高的肿瘤之一，其发病率位居各种肿瘤的第5 位［3］。汉黄芩素是唇形科植物黄芩主要的活性化合物之一，存在于植物的根茎中，属于黄酮类化合物，在体内和体外都具有显著抗炎、抗病毒、神经保护和抗肿瘤作用。国内外许多研究发现，汉黄芩素具有显著抑制人卵巢癌细胞A2780、人肝癌细胞SK-HEP-1、人乳腺癌细胞等的作用;另外应用肿瘤致死剂量的汉黄芩素对正常免疫细胞无没有毒性;动物试验也进一步证实，汉黄芩素对荷载肿瘤的动物有效治疗剂量对动物无毒副作用［4-8］。因此对汉黄芩素的进一步研究具有重要意义。目前国内外少有应用汉黄芩素提高CD3AK 细胞杀伤肝癌细胞研究的报道。也无应用汉黄芩素提高免疫效应细胞杀伤肿瘤敏感性的研究。为此本课题从汉黄芩素抑制肝癌细胞转移相关分子(细胞迁移、Ezrin蛋白等)、汉黄芩素提高CD3AK 细胞增殖和杀伤肿瘤活性的作用机理及汉黄芩素提高CD3AK 细胞对肝癌细胞杀伤敏感性等途径进行系列研究。

CD3AK (anti-CD3 antibody induced activated killer cells)是指在体外用抗人CD3 单克隆抗体和IL-2 等细胞因子激活的杀伤细胞。CD3AK 细胞是以CD3+CD8+T 为主的异质群细胞，有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、在体内分泌细胞因子能力强以及临床应用安全性高及低毒副作用等优势［9-13］，已成为肿瘤细胞免疫治疗的重要效应细胞之一。在免疫原性强的肿瘤病人体外培养的CD3AK 细胞中可有一定数量的肿瘤抗原特异性细胞毒T 细胞。

PFP 是一种糖蛋白，能以钙离子依赖方式在靶细胞膜上形成穿孔素管状通道，进而导致靶细胞渗透性溶解破坏［14］。GraB 是具有天冬氨酸酶活性的丝氨酸蛋白酶，它能够通过caspase 依赖途径、不依赖caspase 的胞质途径及直接入核途径杀伤靶细胞［15］。CD107a 分子是抗原特异性细胞活化以后的脱颗粒过程密切相关蛋白，是杀伤性T 细胞脱颗粒以后，细胞溶解性颗粒的胞膜与T 细胞膜融合的证据［16］。本研究FCM 结果显示，浓度为0.8～3.2 mg/L 的汉黄芩素作用后，CD3AK 细胞表面的PFP、GraB 和CD107a 的表达率均明显高于对照组(P ＜0.05)，提示上述浓度的汉黄芩素能够上调细胞PFP 和GraB 的表达，当汉黄芩素浓度为50 mg/L时，PFP 的表达率低于对照组(P＜0.05)，提示高浓度的汉黄芩素能够下调CD3AK 细胞的功能。本实验表明，浓度为0.2～6.2 mg/L 的汉黄芩素作用CD3AK 细胞48 h 后，对肝癌SMMC-7721 细胞株细胞的杀伤活性随着汉黄芩素浓度的增加而逐渐增强，浓度为3.2 mg/L 时达峰值，大于6.2 mg/L 时，其杀伤活性呈下降趋势，提示汉黄芩素对CD3AK细胞的作用存在浓度窗现象。

细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是ERK 家族的重要成员，其活化形式是磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)，通常认为ERK 磷酸化代表ras/raf/MAPK 信号通路的活化。胞外刺激可经G 蛋白受体、生长因子受体和酪氨酸蛋白激酶受体，经Ras-Raf-MEK-ERK 级联信号激活ERK，通过影响下游效应分子的活性，在细胞的活化、增殖和凋亡中起着重要作用［17，18］。我们的实验研究发现，汉黄芩素浓度在12.5～0.8 mg/L 时，ERK1/2 蛋白表达高于对照组，提示汉黄芩素能够上调细胞中p-ERK1/2的表达，考虑为汉黄芩素激活细胞的ras/raf/MAPK 信号通路，进而引起CD3AK 细胞的增殖。当汉黄芩素浓度达50 mg/L 时，细胞p-ERK1/2 蛋白的表达量较0.15～10 mg/L 时低，考虑为高浓度的汉黄芩素对CD3AK 细胞产生抑制作用，可能为p-ERK1/2 与CD3AK 细胞凋亡有关。汉黄芩素影响CD3AK 细胞增殖和体外杀伤活性的具体机制目前尚不清楚，推测可能与胞内信号通路的异常活化有关。T 细胞活化时信号传递由T 细胞表面抗原识别受体(T cell receptor，TCR)介导，外来信号经受体及相关蛋白传递给胞内的蛋白酪氨酸激酶，此后启动三条下游信号途径:一为磷脂酶 C-γ1(PhospholipaseC-γ1，PLC-γ1)介导的信号途径，二为Ras-MAPK 途径，三为共刺激分子介导的磷酸肌醇激酶-3(PI3K)辅助信号途径。这3 条途径中都存在一个非常重要的环节:活化信号要依靠激活的ZAP-70 磷酸化接头蛋白LAT 和SLP-76 进行进一步的传递。有研究发现，LAT 经酪氨酸激酶活化后，与SLP-76 通过Gads 结合成复合体，募集连接PLCγ1、Vav、PI3K、Itk 以及Sos 等多种重要的信号传导分子，形成以LAT 为核心的信号转导复合体，激活T细胞活化信号传导的下游途径(磷酯酰肌醇途径和Ras-MAPK 途径)。ERK1/2 位于胞浆内，其信号通路被认为是经典的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路，一旦被激活，能迅速穿过核膜并通过磷酸化反应调节某些转录因子的活性，引起特定蛋白的表达或活性改变，与细胞生长发育、炎症、应激和病毒的感染复制等过程密切相关［19-21］。这些研究显示转录因子NF-AT、AP-1、NF-κB 可能是ERK1/2 信号通路影响T 淋巴细胞活化、增殖、凋亡等生物学行为的关键环节。

CD3AK 细胞是肿瘤治疗的免疫效应细胞之一，具有广阔应用前景。细胞免疫治疗的疗效的关键是能否培养出高度免疫活性的抗肿瘤效应细胞。因此如何获得足够数量并具有高细胞毒活性的效应细胞已成为CD3AK 细胞治疗成功的关键。本实验证实汉黄芩素能激活ERK1/2 信号通路促进CD3AK 细胞增殖，并通过提高免疫效应细胞的颗粒酶B、穿孔素及CD107a 的表达提高其杀伤活性。同时汉黄芩素还能直接抑制肝癌细胞SMMC-7721 生长，减少SMMC-7721 细胞的迁移率，减缓SMMC-7721 细胞生长融合时间。这些结果为汉黄芩素的临床应用提供了一定的实验依据。

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