减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究①

尚 珂 张俊峰 程相朝 张春杰 李银聚 陈桂华 颜云飞 翟崇凯 赵战勤

(河南省动物疫病与公共安全院士工作站/河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室，洛阳 471003)

近年来，减毒沙门菌活疫苗载体已经被应用于诸多领域，尤其是在无抗性宿主-载体平衡致死系统被成功构建以来，更是受到了学者们的青睐，因而是当前的重点研究对象之一。减毒沙门菌能够将来自病毒、细菌、寄生虫的保护性抗原基因有效地递呈给免疫系统，诱导出针对该外源基因的特异性黏膜、细胞及体液免疫反应，因此其应用前景非常广阔［1］。在国内外，减毒沙门菌作为活疫苗载体的研究主要应用于鼠伤寒沙门菌，而猪霍乱沙门菌作为活疫苗载体的研究相对较少。

猪霍乱沙门菌属于革兰氏阴性胞内侵袭性细菌，是引起人类食物中毒和仔猪副伤寒的主要病原之一。理想的减毒沙门菌活疫苗载体依赖于合适的减毒沙门菌菌株。本室为开发应用于猪的口服活疫苗载体，前期已成功构建出减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaC78-1［2］。其中毒力基因crp 和cya 分别编码了环一磷酸腺苷受体蛋白(cAMP receptor protein)和腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase)。crp和cya 同时缺失之后会降低对某些营养物质的运输以及碳源的利用能力，影响鞭毛、菌毛和外膜蛋白的合成，从而使其毒力显著降低。国内外研究均表明，该类双缺失株比crp 和cya 单缺失株毒力更低，且具有良好的免疫原性［3］。

asd 基因属于营养缺陷型标志基因，编码了天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶，是二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的一种关键酶，而DAP 又是构成革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖的基本成分，因此在无外源DAP补充的条件下asd 基因缺失株将会裂解死亡［4］。因此，本文在减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaC78-1 的基础上，进一步缺失asd 基因，以营养选择标志代替抗生素的抗性标记，并将携带完整asd 基因的互补质粒pYA3493 电转至该缺失株，构建无抗性宿主-载体平衡致死系统ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)，为开发应用于猪的稳定携带异源基因的口服活疫苗载体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及培养条件 减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaC78-1、弱毒疫苗株C500、重组自杀性质粒pREΔasd 及其宿主菌大肠杆菌χ7213(Thi-1 thr-1 leuB6 fhuA21 lacY1 glnV44 ΔasdA4 recA1 RP4 2-Tc Mu［λpir］Kmr)由本室保存，各培养基根据需要加入终浓度为25 μg/ml 的氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、100 μg/ml 的氨苄青霉素(Amplicillin，Amp)、50 μg/ml 的二氨基庚二酸(DL-α，ε-Diaminopimelic acid，DAP)。

1.2 主要试剂、培养基和实验动物 11 种沙门菌属诊断血清及各种单因子血清购自宁波天润生物药业有限公司;二氨基庚二酸(DAP)、氯霉素(Cm)购自Sigma-Aldrich 公司;Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID 公司;质粒小量提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;凝胶回收试剂盒购自生工生物工程有限公司;麦康凯琼脂和生化鉴定试剂均购自杭州天和微生物试剂有限公司。6～8 周龄KM 雌鼠购自郑州大学实验动物研究中心。

1.3 引物的设计和合成 根据NCBI 中GenBank收录的鼠伤寒沙门菌LT2(No.AE008859)中的asd基因序列设计相关引物。引物Pi1/Pi2 用于猪霍乱沙门菌的特异性鉴定。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 猪霍乱沙门菌缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 的构建 根据相关文献［5，6］所述的方法并加以改进。首 先 以 χ7213 (pREΔasd)为 供 体 菌，ΔcrpΔcyaC78-1 为受体菌进行接合转移。供体菌接种于含氯霉素(Cm)和二氨基庚二酸(DAP)的LB液体培养基，受体菌接种于LB 液体培养基上，37℃摇床培养过夜，然后各取100 μl 菌液，再加入3 ml LB 液体培养基混匀，继续培养6 h，之后取出100 μl菌液涂布于含氯霉素的LB 固体平板上培养15～24 h，挑选Cm 抗性的接合子，用引物pa1/pa2 扩增鉴定。阳性接合子在含DAP 和10%蔗糖的NB(不含NaCl 的LB)液体培养基中培养过夜，连续10 倍稀释选取合适的稀释度涂布于含DAP 和10%蔗糖的NB(不含NaCl 的LB)固体平板上，培养15～24 h，挑取光滑透明单菌落同时划线于含DAP 和10%蔗糖的NB(不含NaCl 的LB)固体平板和不含DAP 含10%蔗糖的NB 固体平板上，筛选DAP 依赖且蔗糖抗性(SUCr)的菌落，用引物pa1/pa2 扩增鉴定，阳性菌落进一步用pa2/pa3 扩增鉴定。

1.5 重组菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的构建及鉴定 将-70℃保存的χ6097(pYA3493)划线接种于LB 固体平板，过夜培养后挑取单菌落接种于4 ml 的LB 液体培养基，37℃200 r/min 振荡培养15 h 后，提取互补质粒pYA3493。取5 μl 质粒加入100 μl ΔcrpΔcya-ΔasdC78-1 的电转化感受态中混合均匀，冰浴30 min，将混合物迅速转移至预冷的电击杯中，放入基因导入仪进行电转化。电转参数如下:电压2 000 V、电阻200 Ω、电容25 μF、放电时间不超过6 ms。电击后迅速加入400 μl 预热的LB 液体培养基，37℃180 r/min 振荡培养3 h，最后取出100 μl 涂布于不含DAP 的LB 固体平板上。15～24 h后挑取无色单菌落分区接种于LB 固体培养基，待菌落长出之后用引物pa2/pa3 扩增鉴定。

表1 PCR 扩增所用的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

1.6 重组菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的生物学特性研究

1.6.1 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的表型鉴定将疫苗株C500、ΔcrpΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(pYA3493)划线接种于含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基和LB 琼脂培养基，培养15 h 后进行O 和H 抗原等血清型鉴定，再分别转接于含葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇等碳源生化鉴定培养基进行生化反应，同时进行VP、MR、H2S 产生试验。

1.6.2 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的遗传稳定性 将ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)划线接种于LB 固体培养基，挑取单菌落接种于LB 液体培养基中，37℃、180 r/min 培养16 h，按比例1 ∶100 转接新鲜LB 液体培养基中培养12 h，重复上述步骤连续转接60 次，取第10、20、30、40、50、60 代菌液，用引物pa1/pa2 进行PCR 鉴定，以研究Δasd 基因的遗传稳定性。

1.6.3 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的生长特性研究 分别挑取疫苗株C500、ΔcrpΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的单菌落，接种于LB 液体培养基中37℃培养过夜，取100 μl 菌液连续稀释至合适浓度，并作3 个重复，37℃培养过夜，计数并计算原液浓度。转接菌液至新鲜培养基，调整浓度至1×106CFU/ml，37℃、180 r/min 振摇培养。每隔1 h 取一次样，按上述方法平板计数，绘制三者的生长曲线。

1.6.4 重组菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(PYA3493)的毒力测定 为测定重组菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)对6～8 周龄的KM 雌鼠的毒力，将60只小鼠随机分为3 个大组，每个大组包含4 个小组，将 C500、ΔcrpΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)分别划线于LB 固体培养基上，37℃培养过夜，再分别挑取单菌落，接种于LB 液体培养基，按设定的剂量口服攻毒小鼠，浓缩或稀释菌液，每只攻毒200 μl，另作无菌PBS 对照组，连续观察28 d，用Bliss 软件计算各组的LD50。

2 结果

2.1 猪霍乱沙门菌缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 的构建与鉴定 供体菌与受体菌在LB 液体培养基混合培养的过程中，发生第一次同源重组，重组自杀性质粒pREΔasd 被整合至ΔcrpΔcyaC78-1 的染色体上，故阳性接合子同时具有asd 基因的两个拷贝，即缺失型(315 bp)和完整型(1 803 bp)，其表型为氯霉素抗性蔗糖敏感(CmrSUCs)。因此用该基因的上臂内部引物pa1 和下臂内部引物pa2 进行PCR 扩增，可同时扩得asd 缺失型(315 bp)和asd 完整型(1 803 bp)两个条带(图1A)。pREΔasd 含有反向选择基因sacB 即蔗糖敏感基因，因此阳性接合子在含DAP 和10%蔗糖且不含NaCl 的LB 液体培养基中培养会发生第二次同源重组。重组之后只有两种结果，恢 复 为 ΔcrpΔcyaC78-1 或 突 变 为ΔcrpΔcyaΔasdC78-1。挑取单菌落用引物pa1/pa2 PCR 扩增鉴定，可扩得315 bp(ΔcrpΔcyaΔasdC78-1)和1 803 bp(ΔcrpΔcyaC78-1)两种条带(图1B)。为了证明扩增所得的缺失片段来自于染色体而不是自杀性质粒，阳性菌落进一步用上臂外部引物pa3 和下臂内部引物 pa2 进行 PCR 扩增鉴定，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 可 扩 得2 229 bp 的 片 段，ΔcrpΔcyaC78-1 可扩得3 717 bp 的片段，而pREΔasd无法扩出任何条带(图1C)。此时所得到的菌株呈氯霉素敏感蔗糖抗性(CmsSUCr)。由此表明，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 构建成功。

图1 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1PCR 鉴定Fig.1 PCR identification of ΔcrpΔcyaΔasdC78-1

图2 PCR 鉴定ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)Fig.2 PCR identification of ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA 3493)

图3 C500，ΔcrpΔcyaC78-1 和ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA 3493)在培养基上的生长情况Fig.3 Growth of C500，ΔcrpΔcyaC78-1 and ΔcrpΔcya ΔasdC78-1(pYA3493)on medium

2.2 重组菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的构建与鉴定 首先用引物pa2/pa3 可扩增出2 229 bp左右的目的片段，说明asd 基因在染色体上发生了缺失，即该菌株为ΔcrpΔcyaΔasdC78-1。其次，该菌株能够在不含DAP 的LB 固体培养基上生长，说明含asd 基因的互补质粒pYA3493 成功表达了二氨基庚二酸，即pYA3493被成功导入了ΔcrpΔcya ΔasdC78-1。由此可知ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA-3493)构建成功。

图4 PCR 鉴定Δasd 缺失片段的稳定性Fig.4 PCR identification of stability of Δasd mutant

图5 C500、ΔcrpΔcyaC78-1 与 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)生长曲线Fig.5 Growth curves of C500，ΔcrpΔcyaC78-1 and ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)

2.3 重组菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的生物学特性

2.3.1 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的表型鉴定ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 的血清型与ΔcrpΔcyaC78-1和疫苗株C500 相同，均为6，7:C:1，5。疫苗株C500 在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上呈红色菌落，可利用麦芽糖，而ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)和ΔcrpΔcyaC78-1 保持一致，均不能利用麦芽糖，在含1%麦芽糖的麦康凯琼脂培养基上呈无色菌落，且在LB 固体平板上成光滑透明的乳白色菌落(图3)。生化试验结果表明，ΔcrpΔcya ΔasdC78-1 (pYA3493)利用碳源的能力与ΔcrpΔcyaC78-1 基本相同，但与C500 相比，只保留了利用葡萄糖的能力，不能够完全利用半乳糖，完全失去了利用麦芽糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇的能力(表2)。

2.3.2 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)asd 缺失型片段及质粒 pYA3493 的遗传稳定性将ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3494)在LB 液体培养基中连续转接60 代，取第10、20、30、40、50、60 代菌液为模板用引物pa1/pa2 PCR 扩增鉴定，均可扩增出315 bp 的缺失型片段，而ΔcrpΔcyaC78-1 则扩出1 803 bp 的完整型片段(图 4)，由此表明ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3494)能够稳定遗传315 bp 的asd 缺失型片段。该菌株能够在不含DAP 的LB 液体培养基中连续传代培养，说明质粒起到了营养互补的作用，连续传代过程中质粒未发生丢失。

表2 C500，ΔcrpΔcyaC78-1 和ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)生化特性比较Tab.2 Comparison of biochemical characteristics of C500，ΔcrpΔcyaC78-1 and ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)

表3 重组菌株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 (pYA3493)、ΔcrpΔcyaC78-1 及疫苗株C500 的口服攻毒结果Tab.3 Oral infection results of ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 (pYA3493)，ΔcrpΔcyaC78-1 and C500

2.3.3 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)、ΔcrpΔcya C78-1 及疫苗株C500 的生长特性 调整三者菌液起始浓度至1×106CFU/ml，37℃、180 r/min 振荡培养，每隔1 h 取100 μl 菌液适当稀释涂板，培养计数，绘制三者生长曲线。由生长曲线可以看出，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3494)的生长速度略慢于ΔcyaΔasdC78-1，且二者明显慢于疫苗株C500。见图5。

2.3.4 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的毒力测定 由表3 可知，口服感染 ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的 LD50 是 7.62 × 1012CFU，ΔcrpΔcyaC78-1 的LD50 是5.95×1012CFU，C500 的LD50 是 1.85 × 1010CFU，ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)的半数致死量约为C500 的412 倍。

3 讨论

首先，自杀性质粒作为一种构建精确缺失株的有效载体具有以下特性:(1)自杀性质粒含有缺陷型R6K 复制子。该复制子只有在由pir 基因编码的π 蛋白存在的条件下才能复制，而大肠杆菌χ7213转导有可反式提供π 蛋白的含pir 基因的λ 原噬菌体，故自杀性质粒可在χ7213 中复制，而不能在不含λpir 的细菌中复制。只有当自杀性质粒通过第一次同源重组整合至宿主菌的染色体上，才能通过其氯霉素抗性筛选到阳性接合子。(2)自杀性质粒含有RK2 的转移起始区(mobRK2)，该区域具有潜在的诱动能力，为其通过同源重组的方式进入受体菌提供了物质基础。(3)自杀性质粒同时含有正向选择基因Cm 和负向选择基因SacB。SacB 编码了果聚糖蔗糖酶，该酶催化蔗糖生成了一种可致死革兰氏阴性菌的有毒化合物即果聚糖［7］。实验中作者发现，按照传统的筛选步骤，在第二步筛选的过程中，阳性接合子在含DAP 和5%蔗糖的NB(不含NaCl的LB)液体培养基中培养过夜，其实还存在第三种情况，即阳性接合子未发生第二次同源重组，故需要连续传代才有可能筛选出asd 缺失株。因此将蔗糖的浓度由5%提升至10%，可快速提高第二次同源重组的效率，大大缩短筛选的时间。即不需要连续传代，仅在第一代就可以快速筛选出asd 基因缺失菌株。

其次，菌株的选择。在我国，预防仔猪副伤寒的标准弱毒疫苗株是C500。疫苗株C500 是由抗原性良好的猪霍乱沙门菌强度株C78-1 经化学诱变的方法得到，田间和区域试验均证明安全有效，在全国推广使用取得了可观的经济效益和社会效益。故赵战勤［8］在疫苗株C500 的基础上构建了ΔasdC500 平衡致死系统。为克服疫苗株C500 毒力致弱背景不清且留有残毒的缺陷，张明亮［9］构建了ΔcrpΔasd C78-1 平衡致死系统，其毒力较疫苗株C500 下降了约1.5 倍，但本文所使用的缺失株ΔcrpΔcyaC78-1其毒力(腹腔攻毒)较疫苗株C500 下降显著，约103倍［2］，且该类双缺失株在国外的同类研究中也已被证明保留有较好的免疫原性，故相对于疫苗株C500而言，缺失株ΔcrpΔcyaC78-1 可能更适合用于开发携带外源基因的口服活疫苗载体。

1992 年，田京慧等［10］构建了重组鼠伤寒沙门菌ΔcyaΔcrpΔasd χ4072(pYA-ctxB)，成功表达了霍乱毒素B 亚单位基因，口服该菌株对伤寒和霍乱毒株均有良好的免疫力。2003 年，白杨等［11］构建了重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd χ4072(pYA-248AB)，成功表达了幽门螺杆菌(Hp)黏附素保守区(AB)，口服该重组菌株其致死剂量是野生株χ3181 的103倍［11］。2011 年，穆沛红等［12］构建了表达E 型脑炎病毒的重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗ΔcrpΔcyaΔasdχ4550(pYA-3341-E)，该重组菌能够稳定表达乙型脑炎病毒E 蛋白，口服该疫苗能够诱发特异性的细胞及体液免疫反应。以上文献均表明以crp、cya、asd 三基因构建的减毒鼠沙门菌平衡致死系统可以作为活疫苗载体高效表外源基因。同理，可以此三基因构建减毒猪霍乱沙门菌平衡致死系统用于外源基因的表达。本文所构建的猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)其血清型、生长速度、生化特性、毒力均与ΔcrpΔcyaC78-1 基本相同，说明将互补质粒pYA3493 电转化至缺失株ΔcrpΔcyaΔasdC78-1 后没有改变其生物学特性。小鼠口服攻毒实验表明本文所构建的猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)其半数致死量约为疫苗株C500 的412 倍，可见缺失上述基因构建平衡致死系统其毒力下降非常明显。

综上所述，本文通过基因工程所构建的减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(pYA3493)平衡致死系统其毒力较疫苗株C500 降低显著，安全性较高，不存在毒力返强的风险，且遗传及致弱背景清晰，故有潜力作为高效表达外源基因的口服活疫苗载体。

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