肿瘤来源自噬小体刺激B 细胞活化的实验研究①

李卫霞 周 猛 任宏艳 曹 萌 王立新 (东南大学医学院病原生物学与免疫学系，南京 210009)

肿瘤来源的自噬小体(Tumor derived-autophagosomes，TDA)作为肿瘤抗原的有效载体，能诱导抗肿瘤免疫应答［1］。用蛋白酶体抑制剂、自噬诱导剂处理细胞后分离得到的自噬小体中含有较多短寿蛋白及核糖体错误编码产品［2］。肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子递呈肽段通常来源于短寿蛋白和核糖体错误编码蛋白［3］，因而DC 依赖CLEC9A 及其配体能有效识别TDA 并加工处理TDA 抗原，最终交叉提呈TDA 抗原并诱导CD8+T 细胞的活化［4］。研究证实TDA 与可溶性蛋白抗原或完整的肿瘤细胞相比，能诱导更强的T 细胞应答［1］。

B 细胞是重要的抗体分泌细胞，抗体作为机体抗感染的有效屏障，在疫苗的研究中具有重要作用［5-8］。因而对TDA 刺激B 细胞应答，并诱导B 细胞分泌抗体的研究也显得尤为重要。但是TDA 能否增强B 细胞表面MHC 以及共刺激分子的表达，并最终刺激抗体的分泌作用还不清楚。本文通过比较TDA 与细胞裂解液对B 细胞的体外刺激作用，证实TDA 在体外能更有效地刺激B 细胞的增殖、活化，并促进B 细胞分泌IgM。

1 材料与方法

1.1 材料 实验选用C57BL/6 雌性小鼠，6～8 周龄，体重18～20 g，购自扬州大学比较医学中心;Hep1-6 和B16F10 细胞株，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;RPMI1640 培养基购自美国Gibco 公司;胎牛血清购自Hyclone 公司;Bradford 蛋白检测试剂盒购自碧云天生物技术公司;LPS 购自Sigma Aldrich 公司;CFSE、CD43 抗体偶联磁珠分选试剂盒购自Invitrogen 公司;荧光标记抗体APC-B220 购自BD Bioscience 公司;PEB220、FITC-H2-Kb、FITC-I-Ab、PE-CD40 体及PECD86 购自eBioscience 公司;IgM 检测试剂盒购自美国Jackson Immuno-Research 公司。

1.2 肿瘤细胞培养及TDA、细胞裂解液制备 Hep1-6 和B16F10 细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞贴壁良好，密度适中后，按照Li［9］的方法，提取细胞上清中的TDA，保存于-20℃;收集生长状态良好的贴壁细胞，PBS 洗涤3 次，PBS 重悬，37℃～-20℃反复冻融6次，裂解细胞，以Bradford 法测定TDA 和细胞裂解液中总蛋白的含量。

1.3 透射电子显微镜鉴定TDA 的形态 将收集Hep1-6 细胞和TDA 用2.5%戊二醛固定，送至南京军区总医院电镜室进行冰冻切片，电镜观察TDA 的大小、形态。

1.4 TDA 体外刺激脾脏B 细胞的增殖 取野生型C57BL/6 小鼠脾细胞，5 μmol/L CFSE 标记细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液重悬细胞，48孔板培养，2×106个细胞/孔，每孔分别加入10 μg/ml TDA、10 μg/ml 细胞裂解液、10 μg/ml LPS，并以完全培养液(CM)作为对照，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱孵育第5 天收集细胞，并用PE-B220 抗体染色，流式细胞仪检测B220+细胞CFSE 的衰减。

1.5 TDA 刺激脾脏B 细胞活化作用检测 取野生型C57BL/6 小鼠脾细胞，CD43 抗体偶联磁珠分离B 细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液重悬细胞，48 孔板培养，2×106个细胞/孔，每孔分别加入10 μg/ml TDA、10 μg/ml 肿瘤细胞裂解液，并以完全培养液(CM)作为对照，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱共孵育，第3 天收集细胞，用APC-B220和FITC-H2-Kb、FITC-I-Ab、PE-CD40 以及PE-CD86抗体染色。流式细胞仪检测B220+细胞表面MHC 类分子及共刺激分子的表达。第7 天，收集细胞培养上清，采用ELISA 方法检测上清中总IgM 的水平。

1.6 统计学处理 使用GraphPad Prism5.0 软件对数据进行分析处理，数据结果以±s 表示，组间差异比较采用t 检验。

2 结果

2.1 肿瘤细胞在自然状态下能分泌自噬小体 为证实肿瘤细胞在自然生长过程中能分泌自噬小体，我们收集自然生长状态Hep1-6 肿瘤细胞及培养上清，差速离心法分离上清中的自噬小体。电镜观察发现:正常肿瘤细胞中有少量具有双层膜结构囊泡状自噬小体存在，且细胞培养上清中收集到大量的具有双层膜结构的自噬小体，平均直径在100～1 000 nm 不等(见图1A、C)。为募集更多的自噬小体，我们通过加入万柯阻断短寿蛋白的降解，雷帕霉素诱导自噬小体的生成，并分离上清中的自噬小体，电镜观察结果显示:药物诱导后肿瘤细胞胞浆内含有大量具有双层膜结构的小体，且细胞培养上清中同样收集到大量平均直径在100～1 000 nm 的自噬小体(见图1B、D)。提示:肿瘤细胞在自然生长状态下能够释放自噬小体，且通过加入万柯、雷帕霉素等药物后，能更加有效地募集大量的自噬小体。

图1 电镜检测肿瘤细胞来源自噬小体(TDA)结构Fig.1 Tumors-derived autophagosomes (TDA)were detected by transmission electron microscopy

2.2 TDA 体外刺激B 细胞的增殖 为检测肿瘤细胞来源的自噬小体(TDA)刺激B 细胞增殖的作用，我们将野生型C57BL/6 小鼠脾细胞用CFSE 标记，然后分别与10μg/mlTDA、细胞裂解液、LPS共孵育5 d，收集细胞并用流式细胞仪检测。结果显示，与CM 组相比，用TDA 与细胞裂解液均能显著刺激B 细胞的增殖(CM 组为1.4%，TDA 组为28.6%，细胞裂解液组为4.4%，LPS 刺激组为41.6%)，且TDA 组B 细胞的增殖比率显著高于细胞裂解液刺激组(见图2)。提示:TDA 作为一种颗粒性抗原载体能有效地诱导小鼠脾脏B 细胞的增殖。

2.3 TDA 体外刺激B 细胞的活化 B 细胞的活化状态可根据B 细胞表面活化标志MHC、CD86、CD40的表达来判定［10，11］。为检测TDA 刺激小鼠脾脏B细胞的活化作用，我们将TDA 和同样蛋白浓度细胞裂解液分别与脾脏细胞共孵育3 d，流式细胞仪检测B220+细胞表面MHCⅠ、Ⅱ类分子及共刺激分子CD40 和CD86 的表达情况。结果显示，与细胞裂解液刺激组相比，TDA 刺激显著上调了B220+细胞表面MHCⅠ、Ⅱ类分子及CD40、CD86 共刺激分子的表达(见图3)。提示:TDA 体外能刺激B 细胞的活化。

2.4 TDA 体外刺激B 细胞分泌IgM B 细胞是重要的抗体分泌细胞。为检测TDA 刺激小鼠脾脏B细胞分泌抗体作用，我们用Hep1-6 和B16F10 来源的TDA 及其细胞裂解液分别刺激小鼠的脾脏细胞。第7 天取细胞培养上清，用ELISA 法检测上清中的总IgM 的含量。结果显示:与CM 组相比，两种不同来源的TDA和细胞裂解液均能促进脾脏细胞分泌IgM，且两种不同来源的TDA 刺激脾脏细胞分泌IgM 的水平均显著高于细胞裂解液刺激组(P ＜0.05);而两种不同来源的TDA 刺激脾脏细胞分泌IgM 的水平则无明显差异(P＜0.05)(见图4A)。

图2 TDA 体外刺激B 细胞的增殖作用检测Fig.2 Detection of B cells proliferation stimulated by TDA in vitro

为进一步检测TDA 能否在体外直接活化B 细胞并诱导抗体的产生，我们将磁珠分选脾脏B 细胞分别与Hep1-6 和B16F10 来源的TDA 或肿瘤细胞裂解液共孵育，同时用细胞裂解液刺激组作为对照。结果显示:在无辅助细胞如DCs、Mφ 存在的情况下，两种不同来源的TDA 和细胞裂解液均能刺激纯化的B 细胞分泌IgM，且TDA 刺激纯化B 细胞分泌IgM 水平显著高于肿瘤细胞裂解液刺激组(P ＜0.05)(见图4B)。提示:肿瘤细胞来源的TDA 能有效刺激B 细胞分泌IgM。

图3 TDA 体外刺激B 细胞表达MHC 和共刺激分子检测Fig.3 Expression of MHC and co-stimulated molecules of B cells were stimulated by TDA in vitro

图4 不同细胞来源的TDA 体外刺激B 细胞分泌IgM 作用检测Fig.4 IgM secretion of B cells was induced by TDA-derived from different tumor cells in vitro

3 讨论

自噬是以胞质内出现双层膜结构自噬小体为特征的一系列细胞“自我消化”过程［12-14］，贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程。研究表明，自噬过程中胞浆中可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被双层膜结构包裹形成自噬小体，其大小在300～900 nm之间［15，16］。本研究发现肿瘤细胞通过蛋白酶体抑制剂和自噬诱导剂处理后肿瘤细胞的胞浆内含有大量的泡状结构的自噬小体，该种自噬小体与肿瘤细胞自然生长状态下释放的自噬小体在大小形态方面并无显著差异。

TDA 作为抗原交叉递呈的有效载体，与完整肿瘤细胞抗原和可溶性蛋白质抗原相比，能诱导更强CD8+T 细胞的增殖［17，18］。本研究发现，肿瘤细胞来源TDA 与裂解液中的可溶性蛋白质抗原相比，能更有效地诱导脾脏B 细胞的增殖、活化。TDA 具有多种未知的抗原表位，与多肽或可溶性蛋白相比能诱导更有效的免疫应答［19］。同时，体外用TDA 刺激纯化B 细胞时，同样能有效地刺激B 活化并分泌IgM，表明TDA 能以非T 细胞依赖的方式刺激B 细胞活化分泌抗体。进一步将TDA 刺激混合脾脏细胞中B 细胞的IgM 的分泌水平与纯化的B 细胞进行比较，发现TDA 刺激的脾脏混合细胞分泌IgM 的水平明显高于纯化B 细胞组，表明TDA 刺激脾脏混合细胞中B 细胞的活化可能有其他细胞起了辅助作用，具体情况仍需进一步研究。我们的研究发现TDA 在体外刺激B 细胞能导致IgM 的水平显著增高，而IgG 的水平并未见变化，同时无论用TDA 体外刺激脾细胞或纯化的B 细胞，均未见肿瘤抗原特异性抗体的产生。该结果表明TDA 虽然体外能刺激B 细胞的活化并分泌IgM，但不能导致抗体亲和力成熟和记忆性B 细胞的形成。

Li 等［4］研究证实，DC 通过CLEC9A 受体介导的方式内化并加工、提呈TDA 抗原，诱导T 细胞活化。B 细胞除作为抗体分泌细胞外，还作为专职抗原递呈细胞(APC)在特定条件下发挥交叉递呈抗原的作用［20］，而B 细胞摄取、加工并提呈TDA 抗原的作用及其作用方式还不清楚。

本文研究表明，TDA 在体外能有效地刺激B 细胞的增殖、活化，并促进B 细胞分泌IgM。TDA 诱导B 细胞增殖、活化的分子机制，以及B 细胞作为APC 加工提呈TDA 抗原的作用及机制有待深入研究。

［1］Ravikumar B，Rubinsztein DC.Role of autophagy in the clearance of mutant huntingtin:A step towards therapy［J］.Mol Aspects Med，2006，27(5-6):520-527.

［2］Elliott A，Reiners JJ.Suppression of autophagy enhances the cytotoxicity of the DNA-damaging aromatic amine p-anilinoaniline［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2008，232(2):169-179.

［3］Crotzer VL，Blum JS.Autophagy and intracellular surveillance:Modulating MHC class II antigen presentation with stress［J］.Proc Natl Acad Sci，2005，102 (22):7779-7780.

［4］Li Y，Wang LX，Pang P，et al.Tumor-derived autophagosome vaccine:mechanism of cross-presentation and therapeutic efficacy［J］.Clin Cancer Res，2011，17(22):7047-7057.

［5］Majeski AE，Dice DF.Mechanisms of chaperone-mediated autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2435 -2444.

［6］Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion［J］.Nature，2008，451 (7182):1069-1075.

［7］Birmingham CL，Canadien V，Gouin E，et al.Listeriamono-cytogenes evades killing by autophagy during colonization of host cells［J］.Autophagy，2007，3(5):442-451.

［8］Tanida I，Minematsu IN，Ueno T，et al.Lysosomal turnover，but not a cellular level，of endogenous LC3 is a marker for autophagy［J］.Autophagy，2005，1(2):84-91.

［9］Li Y，Wang LX，Yang G，et al.Efficient cross-presentation depends on autophagy in tumor cells［J］.Cancer Res，2008，68(17):6889-6895.

［10］Deretic V.Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes［J］.Immunol Rev，2011，240(1):92-104.

［11］Schmid D，Munz C.Immune surveillance of intracellular pathogens via autophagy［J］.Cell Death Differ，2005，12(2):1519-1527.

［12］Mitroulis I，Kourtzelis I，Kambas K，et al.Regulation of the autophagic machinery in human neutrophils［J］.Eur J Immunol，2010，40(5):1461-1472.

［13］Lee HK，Lund JM，Ramanathan B，et al.Autophagy dependent viral recognition by plasmacytoid dendritic cells［J］.Science，2007，315(5817):1398-1401.

［14］Sanjuan MA，Dillon CP，Tait SW，et al.Toll-like receptor signaling in macrophages links the autophagy pathway to phagocytosis［J］.Nature，2007，450(7173):1253-1257.

［15］Shahnazari S，Brumell JH.Mechanisms and consequences of bacterial targeting by the autophagy pathway［J］.Curr Opin Microbiol，2011，14(1):68-75.

［16］Gutierrez MG，Master SS，Singh SB，et al.Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages［J］.Cell，2004，119 (6):753-766.

［17］Qian S，Princiotta MF，Bennink JR，et al.Characterization of rapidly degraded polypeptides in mammalian cells reveals a novel layer of nascent protein quality control［J］.J Biol Chem，2006，281(1):392-400.

［18］Basta S，Stoessel R，Basler M，et al.Cross-presentation of the long-lived lymphocytic choriomeningitis virus nucleoprotein does not require neosynthesis and is enhanced via heat shock proteins［J］.J Immunol，2005，175(2):796-805.

［19］Hara T，Nakamura K，Matsui M，et al.Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice［J］.Nature，2006，441(7095):885-889.

［20］de Wit J，Souwer Y，Jorritsma T，et al.Antigen-specific B cells reactivate an effective cytotoxic T cell response against phagocytosed Salmonella through cross-presentation［J］.PLoS One，2010，5(9):e13016.