CXCL8 及其受体CXCR1、CXCR2 在慢性乙肝患者外周血PMNs 中的表达①

王 健 韩忠燕 周 娜 (安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南 232001)

中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)是人体最主要的一种白细胞，在介导抗病原微生物感染的非特异性免疫反应中起重要作用［1］。目前研究表明，PMNs 可表达CXCR1、CXCR2，其与CXCL8 相互作用可募集更多的中性粒细胞，从血管趋向炎症或损伤部位迁移，参与局部和全身的炎症反应［2-4］。为了解慢性乙肝患者外周血PMNs 上CXCL8 其受体CXCR1、CXCR2 表达，本文选择42例慢性乙肝患者外周血PMNs，以链霉亲和素-生物素复合物(Streptavidin-biotin complex，SABC)细胞免疫化学染色法检测其表达，并探讨其临床意义。

1 对象与方法

1.1 对象 所选病例均为我校附属医院和教学医院2011 年12 月至2012 年12 月收治的门诊及住院的慢性乙肝患者42 例，其中，男28 例，女14 例，年龄21～52 岁，平均(43.6±8.4)岁。HBeAg(+)患者17 例，HBeAg(-)患者25 例;PMNs 内HBV DNA(+)患者13 例，HBV DNA(-)患者29 例。入选患者均符合2010 年中华医学会推荐的慢性乙型肝炎防治指南诊断标准［5］。

1.2 试剂与仪器 中性粒细胞分离液购自灏洋生物制品科技有限责任公司;乙型肝炎标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)诊断试剂盒购自上海科华生物股份有限公司;SuperReal PreMix(SYBR Green)试剂盒购自天根生化科技北京有限公司;鼠抗人CXCL8、CXCR1 及CXCR2 单克隆抗体购自LifeSpan BioSciences 公司;二抗、SABC试剂盒、显色试剂盒及苏木素等均购自武汉博士德生物工程有限公司;黏附载玻片及盖玻片均购自江苏世泰实验器材有限公司。5415D 高速离心机(德国Eppendorf 公司);EXL808 型酶标分析仪(美国Bio-Tek 公司);梯度PCR 仪TP600 购自日本TaKaRa 公司;MDF-135 型CO2培养箱(日本Sanyo公司);iCycle®荧光实时定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司;Hema-2000 凝胶扫描分析系统购自珠海Hema 公司;Nikon-E400 荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 PMNs 提取 取患者晨起新鲜外周抗凝血3 ml，小心置含3 ml 中性粒细胞分离液表面，室温2 000 r/min 常规离心35 min，见全血分为血浆、PBMCs 层、中性粒细胞分离液与PMNs 混合层、红细胞(Red blood cells，RBCs)层。弃血浆层和PBMCs 层，小心吸取中性粒细胞分离液和PMNs 混合层，以无Ca2+、Mg2+HBSS 稀释至5 ml，混匀，重悬浮细胞;2 000 r/min 离心10 min，管底呈现红色团块，含PMNs 和残余RBCs。弃上清;加1 ml RBC 裂解液以裂解残余的RBCs，涡旋振荡数秒;1 500 r/min 离心5 min;弃上清;重复上述步骤，进一步清除残余的RBCs，加入250 μl 浓度为20 ml/L 的HBSS/HSA 重悬细胞，计数并调整细胞浓度至(1～2)×106ml［6］。

1.3.2 PMNs 纯度、活度检测 取新分离、纯化的PMNs 以瑞氏染色镜检。镜下计数100 个细胞，中性粒细胞活度=中性粒细胞数/100 ×100%。用新鲜配制的0.4%台盼蓝染液和细胞悬液以1 ∶9 的比例混匀后3 min 内在显微镜下计数活细胞和死细胞，活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。所提PMNs 纯度＞95%，PMNs 活度＞95%。

1.3.3 血清HBeAg 及PMNs 内HBV-DNA 检测取患者血清及阴、阳对照样品各50 μl 分别与50 μl酶结合物加至各自检测孔中，封板，37℃孵育30 min后甩去液体，每孔加1 ∶20 稀释的洗涤液200 μl，静置30 s 后甩干，重复3 次，扣干，各孔分别加显色剂A、B 各50 μl，摇床混匀，封板，37℃孵育15 min，各孔分别加终止液50 μl，空白孔调零，450 nm 波长下测各孔吸光度，记录结果，并依此结果将入选患者分为HBeAg(+)组与HBeAg(-)组。

分别取50 μl 上述PMNs 悬液和血清置于含50 μl SDS 裂解液的离心管中，混匀，沸水浴15 min，冰浴冷却5 min，12 000 r/min 离心3 min，取上清液2 μl 与10 μl 2×SuperReal PreMix、6.8 μl RNase-Free ddH2O 以及上下游HBV-DNA 引物各0.6 μl 混合，点动离心收集反应液后置于Bio-Rad 荧光定量PCR-iQ5 扩增仪上95℃15 min，95℃10 s，55℃30 s，72℃32 s，共40 个循环，检测PMNs 内HBVDNA，并依此结果将入选患者分为HBV DNA(+)组及HBV DNA(-)组。

1.3.4 SABC 法免疫细胞化学染色 取PMNs 细胞悬液涂片，待干燥后冰丙酮固定15 min;新鲜配制3% H2O2溶液中室温浸泡30 min，新鲜ddH2O 冲洗3 min×3 次;滴加50 μl 5% BSA，37℃孵育30 min后甩去多余液体;滴加50 μl 一抗(1 ∶400 稀释)，4℃过夜后37℃孵育1 h;PBS 洗3 min×3 次。滴加50 μl 生物素化的二抗IgG，37℃孵育30 min;PBS 洗3 min×3 次，滴加50 μl SABC，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3 次;DAB 显色:取1 ml 双蒸水，加试剂盒中A、B、C 试剂各1 滴，混匀后每孔加100 μl，室温显色5 min。双蒸水洗涤，5 min×3 次;Mayor 苏木素复染30 s 左右，自来水及Na2HPO4溶液中各2 min;75%、85%、95% 和100% 无水乙醇下分别脱水3 min，干燥后中性树胶封片。其中阴性对照中用PBS代替一抗，阳性对照由LifeSpan BioSciences 公司提供。

1.3.5 SABC 染色结果评判标准 以细胞涂片染色呈黄色作为阳性标准，参照Shimizu 等［7］判断标准，分别按染色深度及分布进行光镜分析并记分。根据细胞染色强度可分为4 级:0 分为阴性，蓝色;1分为弱阳性，浅黄色;2 分为中度阳性，黄色;3 分为重度，棕黄色;根据阳性细胞数占视野总细胞数的比例分为0 分为＜10%、1 分为10%～30%、2 分为31%～60%、3 分为＞60%，共4 级，最终评分值=阳性细胞比例评分值×染色程度评分值，总评分标准:小于3 分者为(-);3 至6 分者为(+);大于6 分者为(++)。

1.4 统计学分析 采用SPSS16.0 统计软件对数据进行分析，组间采用卡方检验或Fisher 确切概率法，P＜0.05 被认为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有显著性统计学意义。规定检验水准α=0.05;若总体有差异，修正检验水准α=0.016 7，进一步进行各个变量不同表达的两两比较，α＜0.016 7 为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 5 进行CXCL8及其受体CXCR1、CXCR2 mRNA 表达与血清ALT、CXCL8 之间相关性分析并作图。相关性分析:0＜| r |≤0.3 为微弱相关，0.3 ＜| r |≤0.5 为低度相关，0.5 ＜| r |≤0.8 为显著相关，0.8 ＜| r |≤1为高度相关。

2 结果

2.1 PMNs 纯度、活度检测结果 瑞氏染色镜检见获检PMNs 边界清晰，胞浆丰富，核分3～5 叶，叶与叶间有细丝相连，提示所提取纯化的PMNs 典型，可满足后续实验要求。见图1。

2.2 SABC 细胞免疫化学染色结果 SABC 免疫细胞化学染色结果显示，CXCL8 主要位于PMNs 胞浆中，CXCR1、CXCR2 多见于胞浆和胞膜上，其中HBeAg(+)者CXCL8、CXCR1 免疫着色较深，而CXCR2 免疫着色较浅;PMNs 内HBVDNA (+)者CXCL8、CXCR1 免疫着色亦较深，而CXCR2 免疫着色亦较浅(见图2、3)。

图1 中性粒细胞瑞氏染色Fig.1 Result of neutrophils with Wright's staining

图2 HBeAg(+)及HBeAg(-)者CXCL8、CXCR1 和CXCR2 染色结果(×1 000)Fig.2 Immunocytochemistry of CXCL8，CXCR1 and CXCR2 in HBeAg(+)and HBeAg(-)(×1 000)

图3 HBV DNA(+)及HBV DNA(-)者CXCL8、CXCR1和CXCR2 染色结果(×1 000)Fig.3 Immunocytochemistry of CXCL8，CXCR1 and CXCR2 in HBV DNA(+)and HBV DNA(-)(×1 000)

图4 血清CXCL8 以及PMNs 内CXCL8、CXCR1/2 mRNA 与ALT 的相关性Fig.4 Correlation of CXCL8 in serum and mRNA of CXCL8，CXCR1/2 in PMNs with ALT

表1 慢性乙肝患者PMNs CXCL8 表达Tab.1 Expression of CXCL8 in PMNs of CHB

表2 慢性乙肝患者PMNs CXCR1 表达Tab.2 Expression of CXCR1 in PMNs of CHB

2.2 慢性乙肝患者外周血PMNs 内CXCL8 表达如表1 所示，42 例慢性乙肝患者PMNs 内HBV DNA(+)组和HBV DNA(-)组中CXCL8 阳性率分别为100%(13/13)和93.1%(27/29)，而HBeAg(+)与HBeAg(-)组CXCL8 阳性率分别为100%(17/17)和92.0%(23/25)，HBeAg(+)组与HBeAg(-)组以及HBV DNA(+)与HBV DNA(-)组之间CXCL8 的表达均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

2.3 慢性乙肝患者外周血PMNs 内CXCR1 表达如表2 所示，42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中HBV DNA(+)组和HBV DNA(-)组CXCR1 的阳性率分别为100% (13/13)和79.31% (23/29)，而HBeAg(+)与HBeAg(-)组CXCR1 的阳性率分别为94.12%(16/17)和80.00%(20/25)，HBeAg(+)组与HBeAg(-)组以及HBV DNA(+)与HBV DNA(-)组之间CXCR1 的表达均有统计学意义(P ＜0.01)。

2.4 慢性乙肝患者外周血PMNs 内CXCR2 表达如表3 所示，42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中HBV DNA 的检出率为30.95%(13/42)，其中HBV DNA(+)组和HBV DNA(-)组CXCR2 的阳性率分别为53.85%(7/13)和48.28%(14/29)，而HBeAg(+)与HBeAg(-)组CXCR1 的阳性率分别为52.94%(9/17)和48.00%(12/25)，HBeAg(+)组与HBeAg(-)组以及HBV DNA(+)与HBV DNA(-)组之间CXCR2 的表达水平均无统计学意义(P＞0.05)。

表3 慢性乙肝患者PMNs CXCR2 表达Tab.3 Expression of CXCR2 in PMNs of CHB

2.5 慢性乙肝患者血清CXCL8 以及外周血PMNs内CXCL8 及其受体CXCR1、CXCR2 表达与ALT 的关系 对比观察患者血清CXCL8 表达与ALT 水平的相互关系，r=0.859，提示两者具有高度相关性;而CXCL8 mRNA 表达与ALT 水平显著相关(r=0.688)。进一步分析CXCR2 mRNA、CXCR2 mRNA与ALT 水平的相互关系，结果显示CXCR1 mRNA与ALT 水平显著相关(r=0.585)，而CXCR2 mRNA与ALT 水平无明显相关性(r=0.088)，如图4 示。

3 讨论

CXCL8 亦称IL-8，又称嗜中性粒细胞因子，可由外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等产生，是炎症性疾病的重要介质，常与局部组织的炎细胞浸润相一致［8］。CXCR1 和CXCR2 是CXCR 家族中的两个重要成员，主要表达于中性粒细胞、CD8+T细胞、CD56+NK 细胞、神经血管内皮细胞、肝转移瘤细胞、肠道表皮细胞等。CXCR1 和CXCR2 拥有共同配体CXCL8，因此，当CXCL8 与CXCR1/2 结合的时候，CXCR1/2 通过与之偶联的G 蛋白，激活下游级联信号转导［9，10］，参与局部和全身炎症反应。

慢性乙型肝炎是HBV 感染机体后以局部单核-巨噬细胞浸润为主的慢性病变［11］，HBV 感染机体后一方面可诱导肝细胞产生CXCL8［12］，另一方面作用于单核巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6［13］，促进单核细胞与血管内皮细胞产生CXCL8，提示慢性乙肝患者CXCL8 水平与肝细胞损伤程度密切相关［14］。通常认为，中性粒细胞在抗病毒感染中不能发挥主要作用，但本文研究发现慢性乙肝患者高水平的CXCL8、CXCR1，高水平的CXCL8 与其特异性受体CXCR1、CXCR2 相互作用，可募集更多的中性粒细胞至肝脏，肝窦内皮间隙可允许小静脉中的PMNs与濒死的肝细胞直接接触，从而参与肝脏的炎性损伤和组织修复。

细胞免疫化学染色法是根据抗原抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质分布的常用方法。SABC 细胞免疫化学染色法以亲和素为桥联，具有三级级联放大作用，较以往SP 法具有更高的灵敏性，且染色背景也更清晰［15］。本文采用该法观察42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中CXCL8、CXCR1 及CXCR2表达，结果显示CXCL8 弥漫性分布于PMNs 胞浆内，CXCR1 及CXCR2 弥漫性分布于PMNs 的胞浆及胞膜上，且CXCL8 和CXCR1 在慢性乙肝患者外周血PMNs 染色程度与患者HBeAg 表达及病毒载量呈正相关，当患者体内HBeAg(+)时，体内病毒复制活跃，HBeAg 作为分泌型的小分子多肽刺激外周血PMNs，使其活化并分泌CXCL8、表达相应受体CXCR1、CXCR2，其中以CXCR1 表达更明显，此可能CXCR1 与CXCL8 有较高亲和性有关;高表达CXCR1 的中性粒细胞又与CXCL8 特异性结合，趋化吸引更多中性粒细胞至局部病灶，参与乙肝慢性化免疫损伤的病理过程。HBV DNA 是反映体内病毒复制的直接指标，HBV DNA(+)提示体内病毒复制活跃，部分病毒颗粒从破损的肝细胞释放入血，与外周血PMNs 相互作用，使CXCR1 表达上调，而CXCR2 并未明显上调，提示CXCR2 在耐受HBV 慢性感染及感染后的损伤修复起重要作用。但中性粒细胞CXCR2 过低表达不利于感染后的损伤修复，Weinger 等［16］研究发现表达CXCR2 的中性粒细胞可降低病毒特异性T 细胞在中枢神经系统的积聚，促进病毒复制，增加死亡率，而应用CXCR1、CXCR2阻断剂可减少病毒感染及其病理损伤。

通常而言，细胞免疫化学着色程度与靶抗原含量呈正相关。42 例慢性乙肝患者外周血PMNs 中，CXCL8 表达阳性率为95.2%(40/42)，其中强表达和弱表达分别为40.5% (17/42)和54.8% (23/42);CXCR1 表达阳性率为85.7%(36/42)，其中强表达和弱表达分别为35.7%(15/42)和50%(21/42);CXCR2 表达阳性率为50%(21/42)，其中强、弱表达分别为9.5%(4/42)和40.5%(17/42)，提示慢性乙肝患者外周血PMNs 中，以CXCL8 及CXCR1 表达升高为主，CXCR2 表达相对较弱，此可能与CXCR1、CXCR2 差异表达有关，前者以介导炎症损伤为主，后者主要参与损伤后组织修复。当CXCR1 大量表达，一部分CXCR1 可形成二聚体，此可作为一种强效CXCR2 受体激动剂，诱导CXCR2表达，促进组织修复［17］。

肝脏是人体重要的免疫器官，谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)是反映肝脏代谢功能的重要指标。当HBV 在体内持续复制，可致肝组织损伤、肝细胞破坏，此时，ALT 可从受损的肝细胞胞浆中释放入血，使血清ALT 水平升高［18］。本文采用GraphPad Prism 5 分析实验结果，发现慢性乙肝患者血清CXCL8 及CXCL8 mRNA 均与ALT 明显相关(r=0.859，P＜0.01;r=0.688)，提示无论从CXCL8的血清游离水平还是基因转录水平均与ALT 水平具有较好的一致性，与Wu 等［19］报道类似，似可作为反映肝脏炎症损伤的辅助指标。CXCR1、CXCR2主要表达于中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞等，IL-8 是其共同配体，其表达水平是反映免疫细胞活化的重要标志［20］。本文研究发现CXCR1 mRNA与ALT 水平有一定相关性(r=0.585)，而CXCR2 mRNA 与ALT 无明显相关性(r=0.088)，提示CXCR1、CXCR2 与IL-8 相互结合发挥生物学作用不完全一致，前者侧重参与乙肝慢性化免疫病理损伤，而后者可能促进损伤后组织修复。

综上所述，中性粒细胞作为一种重要的非特异性免疫细胞，其可通过分泌CXCL8 和表达CXCR1、CXCR2 途径参与慢性乙肝的炎性损伤和修复。SABC 细胞免疫化学染色法具有较高的特异性和灵敏性，可定位观察CXCL8、CXCR1、CXCR2 在PMNs中的表达，其着色程度与患者HBeAg 表达、HBV DNA 载量密切相关;高表达CXCR1 的中性粒细胞又与CXCL8 相互作用，趋化吸引更多中性粒细胞至病灶，参与乙肝慢性化免疫损伤的病理过程，而CXCR2 似可参与患者慢性化过程，促进损伤后组织修复，CXCL8 似可作为反映肝脏炎症损伤的辅助指标。

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