Bcl-6/Blimp-1/IL-21 在原发性干燥综合征中的致病作用

段春巧 杨雯雯 雷玲彦 郭惠芳 张明峰 高丽霞 孙 超

(河北医科大学第二医院免疫风湿科，石家庄 050017)

Bcl-6(B cell lymphoma 6)属于抗细胞凋亡的原癌基因，表达于T、B 淋巴细胞中。当T、B 细胞受到抗原及细胞因子刺激后，促进Bcl-6 的表达，从而加速生发中心的形成［1］，转录因子Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein 1，Blimp-1)与Bcl-6 是一对相互拮抗的转录调节因子，而细胞因子IL-21 与Bcl-6 对生发中心的形成具有协同作用。原发性干燥综合征(Primary Sjögren's syndrome，PSS)是以唇腺组织过量的淋巴细胞浸润形成生发中心为主要病理特征，这些过量的淋巴细胞不仅包括CD4+T 细胞，而且包括CD8+T 细胞、B 细胞、浆细胞和巨噬细胞。从而出现口干、眼干为主要特征的全身性慢性炎性自身免疫性疾病。其病因、发病机制目前尚不明确，目前普遍认为过度活化的滤泡型辅助性T 淋巴细胞(Follicular helper T lymphocytes，Tfh)是原发性干燥综合征免疫病理进程中的中心环节。本文就Bcl-6/Blimp-1/IL-21 在PSS 中的发病机制做一初步研究。

1 对象与方法

1.1 实验组 均来自2012 年3 月至2013 年12 月在河北医科大学第二医院免疫风湿科住院治疗的原发性干燥综合征患者55 例，其中15 例行唇腺活检同时留取标本，符合2002 年PSS 国际分类标准［3］。所有患者均知情同意。其中30 例(继发肾小管酸中毒患者2 例，血液系统受损患者8 例，周围神经病变患者2 例，肺间质纤维化患者5 例，无系统损害的患者13 例)接受唇腺活检，年龄14～78 岁，中位年龄54.5 岁;40 例(其中15 例同意唇腺活检)留取晨起空腹血清，年龄14～78 岁，中位年龄54 岁。同时选择我院口腔外科黏液腺囊肿、下唇外伤等非自身免疫性疾病11 例，行唇腺活检，年龄30～60 岁，中位年龄50.0 岁;30 例体检部1 周内参加体检的健康人群，留取外周血，年龄22～56 岁，中位年龄34 岁。

1.2 临床指标记录 血常规、尿常规、生化全项、免疫球蛋白IgG、自身抗体、胸部CT、病理检查。

1.3 主要试剂 Anti-Bcl-6 antibody 购自BD Biosciences，Blimp-1 Antibody 购自EterLife，人白介素21 ELISA 试剂盒(96tests)购自上海巧伊生物技术有限公司，SP 免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 ELISA 双抗体夹心法检测 于清晨6:00～7:00 之间于肘前静脉采集pSS 患者新鲜空腹静脉血标本，1 h 内完成标本离心，转数选为3 000 r/min，离心时间为10 min。完全分离后的血清迅速分置于若干PC 管内，编号，放置于-80℃冰箱中长期保存;人白介素21 ELISA 试剂盒(96tests)灵敏度可达15 pg/ml，板内、板间变异系数均小于10%。按说明书操作，标准品与待测样本均作复孔，取平均值。

1.5 免疫组化检测 将石蜡包埋的组织切成厚度4 μm 切片，脱蜡;3%甲醛-H2O2溶液，避光封闭15 min，PBS 液洗3 次×5 min;抗原修复即将切片完全浸泡在枸橼酸盐修复液微波修复 80℃× 5 min，40℃×10 min，待自然冷却后，PBS 液洗3 次×5 min;正常山羊血清封闭液封闭，37℃冰箱孵育30 min，甩去多余液体;滴加一抗(抗Bcl-6/Blimp-1)于湿盒中4℃过夜，PBS 液洗4 次×10 min;滴加生物素化第二抗体，37℃冰箱孵育30 min，PBS 液洗3 次×5 min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃冰箱孵育30 min，PBS 液洗3 次×5 min;二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察及时终止显色。苏木素复染，脱水，清洗，中性树胶封片。

1.6 免疫组化结果判定标准 计数5 个高倍镜视野中的阳性细胞数目(检测Bcl-6 时，胞核为淡黄色至棕褐色者为阳性标志，检测Blimp-1 时，胞核为淡黄色至棕褐色者为阳性标志)，并按照阳性细胞数目比例＜1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分为5 个等级，计为0 分、1 分、2 分、3 分、4分;据染色强度分为染色强度弱(淡黄色)、中(棕黄色)、强(棕褐色)三个等级，记为1 分、2 分、3 分，阴性不着色，记为0 分;阳性细胞数目比例评分×染色强度评分做为每例标本最后综合计分，综合记分≥1为表达阳性，＜1 则为阴性［4］。

1.7 统计学分析 数据的统计学处理采用软件SPSS13.0，非正态、方差齐性采用秩合检验;正态、方差齐性采用t 检验。两等级资料间相关性分析采用spearman 相关系数。统计描述采用中位数(Medican，M)、上四分位(Interquartile up，QU)、下四分位(Interquartile low，QL)、均数加减标准差(±s)。以检验水准α=0.05，P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 唇腺组织形态学改变 光镜下观察，正常对照组唇腺组织腺泡大小均匀，导管排列整齐，无扩张，间质无或少量炎性细胞浸润(见图1A);疾病组腺泡大小不等，部分腺体萎缩，以导管周围为明显，间质有1 个或多个灶性淋巴细胞浸润(见图1B)。

2.2 唇腺组织Bcl-6 蛋白的表达 对照组唇腺组织中导管上皮细胞、腺泡上皮细胞的细胞核中未见或极少量Bcl-6 蛋白的表达(见图2A);疾病组Bcl-6蛋白主要表达于淋巴细胞灶中，分布于部分导管上皮细胞及其周围淋巴细胞的细胞核上，多数呈棕褐色强阳性反应，极少数呈淡黄色弱阳性反应;少数间质散在浸润的淋巴细胞亦呈弱阳性反应，腺泡上皮细胞偶尔可检测到阳性细胞(见图2B)，二者差异具有统计学意义(见表1);将疾病组按淋巴细胞浸润情况分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 个等级(见图3)，统计学分析4 个等级间Bcl-6 蛋白的表达差异有统计学意义(见表2)，Bcl-6 蛋白的表达与病理分级呈显著正相关(rs=0.644，P＜0.001)。

2.3 唇腺组织Blimp-1 蛋白的表达 对照组唇腺组织导管上皮细胞、腺泡上皮细胞的细胞核中未见或偶有Blimp-1 蛋白的表达(见图4A);疾病组Blimp-1 蛋白主要表达在异位生发中心，分布于部分导管上皮细胞的胞核中，偶见分布于腺泡上皮细胞的胞核，多数呈棕褐色阳性反应(见图4B);二者差异有统计学意义(见表1);将疾病组按淋巴细胞浸润情况分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个等级(见图5)，统计学分析4 个等级间差异有统计学意义(见表2)，Blimp-1 蛋白的表达与病理分级呈正相关(rs=0.637，P＜0.001)。

2.4 Bcl-6/Blimp-1 在不同脏器损害的PSS 患者唇腺组织中的表达 肾小管酸中毒、血液系统受累、周围神经病变、肺间质纤维化及无系统损害五组间Bcl-6/Blimp-1 蛋白表达，差异无统计学意义(见表3)。

图1 疾病组与对照组唇腺组织病理活检(HE，×400)Fig.1 Pathological biopsy of labial salivary glands(LSG)tissues in disease and control group(HE，×400)

图2 两组唇腺组织中Bcl-6 蛋白的表达(IHC，×400)Fig.2 Expression of Bcl-6 in LSG tissues of two groups(IHC，× 400)

图3 四个病理等级中Bcl-6 的表达(IHC，×400)Fig.3 Bcl-6 expression of four pathological grades(IHC，×400)

表1 疾病组与对照组Bcl-6/Blimp-1 的比较Tab.1 Comparison of Bcl-6，Blimp-1 protein between disease group and control group

图4 两组唇腺组织中Blimp-1 蛋白的表达(IHC，×400)Fig.4 Expression of Blimp-1 in LSG tissues of two groups(IHC，× 400)

图5 四个病理等级中Blimp-1 的表达(IHC，×400)Fig.5 Blimp-1 expression of four pathological grades(IHC，×400)

表2 Bcl-6/Blimp-1 在疾病组不同病理级别中的表达Tab.2 Bcl-6/Blimp-1 expression in different pathological grades

表3 Bcl-6/Blimp-1 在不同脏器损害的疾病组唇腺组织中的表达Tab.3 Comparison of Bcl-6/Blimp-1 protein levels among system involvement of disease groups

表4 IgG 升高组与正常组Bcl-6/Blimp-1 表达水平Tab.4 Comparison of Bcl-6/Blimp-1 level between IgG rise group and normal group

表5 疾病组与对照组血清IL-21 的表达水平(±s)Tab.5 Serum IL-21 levels of two groups(±s)

表5 疾病组与对照组血清IL-21 的表达水平(±s)Tab.5 Serum IL-21 levels of two groups(±s)

Note:Inspection level，α=0.05.

表6 IL-21 在疾病组不同病理级别中表达水平的比较Tab.6 IL-21 expression level in different pathological grades

图6 Bcl-6 与Blimp-1、Bcl-6 与IL-21、IL-21 与IgG 之间的线性关系Fig.6 Correlation between Bcl-6 and Blimp-1，serum levels of IL-21;correlation between serum levels of IL-21 and IgG

2.5 Bcl-6/Blimp-1 与免疫学指标的关系 免疫球蛋白(IgG)升高组、正常组Bcl-6/Blimp-1 蛋白表达，差异无统计学意义(见表4)。

2.6 疾病组与对照组血清IL-21 表达水平的比较两组血清IL-21 表达水平比较经统计学分析具有统计学意义，疾病组高于对照组，见表5。

2.7 疾病组血清IL-21 的表达与唇腺组织病理等级的关系 唇腺活检HE 染色淋巴细胞浸润情况分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 个病理等级，4 个病理等级中IL-21 表达水平具有统计学意义(见表6)。相关性分析，疾病组IL-21 表达水平与唇腺活检病理等级呈正相关，(rs=0.769，P=0.001)。

2.8 Bcl-6/Blimp-1、IL-21/IgG、Bcl-6/IL-21 之间的线性关系 30 例行唇腺活检PSS 唇腺组织中Bcl-6与Blimp-1 的表达成正相关(rs=0.566，P=0.001);留取静脉血的40 例PSS 血清IL-21 的表达水平与IgG 表达水平呈正相关(rs=0.871，P＜0.01);15 例唇腺活检同时留取静脉血的PSS 唇腺组织Bcl-6 的表达与血清IL-21 的表达呈正相关(rs=0.652，P=0.008)。见图6。

3 讨论

干燥综合征是弥漫性结缔组织病中的一种，以侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺体，具有高度淋巴细胞浸润为主要特征。病理上主要表现为外分泌腺体间质大量淋巴细胞浸润形成生发中心(其内大多数为CD4+T 细胞、也有CD8+T 细胞、B 细胞、浆细胞以及巨噬细胞)，其中CD4+T 细胞主要为滤泡型辅助性T 淋巴细胞(Follicular helper T lymphocytes，Tfh)，最近证实Tfh 细胞是生发中心B 细胞分化和生存的重要信号［5］。

Bcl-6 是Tfh 细胞的转录因子，表达于生发中心CD4+T 细胞、B 细胞的细胞核中，促进Tfh 细胞增殖、分化，进一步促进Tfh 细胞表达细胞因子如IL-21，趋化因子CXCR5，共刺激分子ICOS，进而与B细胞相互作用，在CXCL13 的趋化作用下，归巢，最终在唇腺组织中形成淋巴细胞灶，导致腺泡萎缩，导管扩张或狭窄，纤维组织形成。Davis 研究小组于1994 年在实验中发现Blimp-1 是由prdm1(positive regulatory domain zinc finger protein 1)基因表达，在成熟B 细胞终极分化为记忆性B 细胞、浆细胞的过程中起关键的作用［6］，其最显著的特点是促使成熟B 细胞发育为能够分泌抗体的具有浆细胞表型的B细胞。研究发现，CD4+T 细胞中的非Tfh 细胞的细胞核中高表达Blimp-1，与Tfh 细胞的转录因子Bcl-6具有相互拮抗的作用，同时B 细胞中Blimp-1 做为Bcl-6 的拮抗剂可抑制Tfh 细胞分化，反之，Bcl-6 也抑制Blimp-1 表达，促进Tfh 细胞分化［7］。Tfh 细胞数量和功能的异常使自身免疫失衡，对诱发自身免疫性疾病具有重要作用。原发性干燥综合征与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮都属于常见的自身免疫性疾病，虽然它们的病因和发病机制尚不明确，但都与体内的免疫失衡、免疫破坏有关。本课题前期研究显示［13］，在pSS 患者的唇腺组织中，可见大量CXCR5 及IL-21 阳性细胞浸润，提示Tfh 细胞在SS中具有致病作用。本课题研究发现唇腺组织中，疾病组Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表达水平明显高于对照组;疾病组血清IL-21 的表达水平亦明显高于对照组。疾病组唇腺组织Bcl-6 蛋白的表达与唇腺组织Blimp-1 蛋白的表达水平成正相关、与血清IL-21 的表达亦成正相关;疾病组血清IL-21 的表达水平与IgG 水平高低成正相关。Bcl-6/IL-21 在原发性干燥综合征发病机制中的作用:①Bcl-6 的过表达在体内和体外实验中均能导致Tfh 细胞中CXCR5、CXCR4、PD-1、ICOS、IL-21R 和IL-6R 等标记物的上调及CCR7 的下调，并驱动Tfh 细胞的分化［8-10］。②Ettinger 等［11］指出，IL-21 的重要作用之一是促进B细胞的活化，并在体液免疫应答过程中调控B 细胞的分化或凋亡，血清IL-21 水平的增高是大多自身免疫疾病患者的病理性特征表现。在自身免疫病的致病过程中，由于IL-21 对体液免疫的关键性促进作用，机体产生了过量的致病性自身抗体，因此如何以阻断IL-21 的形成为靶点对自身免疫病进行干预治疗，成为新近的研究焦点。

根据Chisholm 唇腺病理分级标准，疾病组按淋巴细胞浸润程度，将唇腺组织分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个等级，实验结果显示，随着浸润淋巴细胞数的增多，Bcl-6/Blimp-1/IL-21 的表达均为增高趋势，说明在唇腺组织中存在大量的Tfh 细胞，而且Tfh 细胞处于活化状态，并与唾液腺受累严重程度密切相关。本实验中，在某些疾病组病例中，虽未达到病理分级诊断标准，但其实验室指标、临床指标均支持，说明Tfh 细胞在PSS 患者早期既存在，进一步说明Tfh 细胞的表达，在诱发及维持生发中心的形成中发挥着重要作用，因此需在下一步的治疗中密切随访、观察患者的临床症状及病理变化。将疾病组按系统损坏分组，经统计学分析显示Bcl-6/Blimp-1/IL-21 的表达水平无统计学差异，因分组后各组样本含量较少，各组间样本量分布不均匀，尚不能说明Bcl-6/Blimp-1/IL-21 参与了Pss 系统损害的发病机制，所以此统计结果的临床价值有待于进一步收集样本、实验、探讨和研究。免疫球蛋白IgG 与Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表达水平作统计学研究发现，升高组与正常组间并无统计学差异。原因可能为:①体液免疫反应是复杂免疫过程，浆细胞分化受众多T、B 淋巴细胞刺激，在PSS 患者发病过程中，除Tfh 细胞对B细胞、浆细胞发挥调节作用外，可能还受辅助性T细胞(T help cell，Th)17 等其他T 细胞亚群的影响，下一步可进行其他T 细胞亚群在pSS 患者致病作用的研究;②研究对象样本含量少，故增大实验误差;③由于标本取得的可行性限制，所选研究对象并不都具备代表性的抗体阳性;但免疫球蛋白IgG 与血清IL-21 的表达水平作统计学研究发现，升高组与正常组组间差异有统计学差异，提示外周循环中高水平的IL-21 与pSS 患者体内免疫球蛋白类别转换存在一定联系［12］，间接体现了IL-21 是pSS 发病时重要的促B 细胞效应因子，可调控B 细胞活化增殖，并调节免疫球蛋白的产生与Ig 的类型，推测血清IL-21 水平异常升高的pSS 患者发生高球蛋白血症时，Ig 的类型更倾向于以IgG 为主的单克隆性球蛋白，一定程度上加重了pSS 的病情活动。

综上所述，pSS 患者唇腺组织生发中心Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表达增高、血清IL-21 表达水平增高，且与唇腺组织中淋巴细胞的浸润程度有关，提示Bcl-6/Blimp-1/IL-21 可能参与了原发性干燥综合征的发病机制，换言之，Tfh 细胞在pSS 患者唾液腺功能损伤中发挥重要作用。通过本实验的研究希望能为原发性干燥综合征病人的治疗提供新的思路，研制出新的生物治疗药物。

［1］TaKaharu Okada，Saya Moriyama，Masahiro Kitano.Differentiation of germinal center B cells and follicular helper T cells as viewed by tracking Bcl6 expression dynamics［J］.Immunol Rev，2012，247:120-132.

［2］Maelara T，Moriyama M，Hayashida JN，et al.Selective localization of T helper subsets in labial salivary glands from primary Sjogren's syndrome patients［J］.Clin Exp Immunol，2012，169(2):89-99.

［3］董 怡.2002 年修订的干燥综综合征国际分类(诊断标准)［J］.中华风湿病学杂志，2002，6:257.

［4］武云霞，孙晓军，李伟丽，等.干燥综合征唇腺组织中Survivin和bcl-2 蛋白的表达［J］.山西医科大学学报，2008，39(1):86-87.

［5］Benson MJ，Erickson LD，Gleeson MW，et al.Affinity of antigen encounter and other early B-cell signals determine B-cell fate［J］.Curr Opin Immunol，2007，19(3):275-280.

［6］Sciammas R，Davis MM.Modular nature of Blimp-1 in the regulation of gene expression during B cell maturation［J］.J Immunol，2004，172(9):5427-5440.

［7］Johnston RJ，Poholek AC，DiToro D，et a1.Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and an tagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation［J］.Science，2009，325(5943):1006-1010.

［8］Yu D，Rao S，Tsai LM，et al.The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment［J］.Immunity，2009，31(3):457-468.

［9］Nurieva RI，Chung Y，Martinez GJ，et al.Bcl-6 mediates the development of T follicular helper cells［J］.Science，2009，325(5943):1001-1005.

［10］Lee SK，Rigby RJ，Zotos D，et al.B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells［J］.J Exp Med，2011，208(7):1377-1388.

［11］Ettinger R，Kuchen S，Lipsky PE.Interleukin 21 as a target of intervention in autoimmune disease［J］.Ann Rheum Dis，2008，67:83-86.

［12］Ettinger R，Sims GP，Fairhurst AM，et al.IL-21 induces differentiation of human naive and memory B cells into antibody-secreting plasma cells［J］.J Immunol，2005，175(12):7867-7879.

［13］雷玲彦，郭惠芳，张明峰，等.Tfh 细胞在原发性干燥综合征中的致病作用［J］.中国免疫学杂志，2014，30(3):392-399.