风湿性心脏病患者的CD4+ CD25+ 调节性T 细胞及细胞因子的改变及意义

汪莲开 (湖北民族学院附属民大医院心血管内科，恩施 445000)

风心病(全称风湿性心脏病，RHD)为自身免疫疾病，是由于急性猩红热或风湿热等链球菌被感染导致的一种变态反应性的心脏病［1］。在我国，RHD俨然已经严重地威胁到了人民的身体健康。大量研究结果显示RHD 体内的自身抗体能够对血管平滑肌、心肌、心外膜和心内膜等起反应，链球菌被感染能激发患者相应的自身免疫性反应，引发病变［2］。本文旨在通过对RHD 患者外周血中转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素6(IL-6)及CD4+CD25+调节性T 细胞(CD4+CD25+Treg 细胞，CD4+CD25+T 细胞)的检测，探讨它们的变化和意义，给临床预防、诊治RHD 提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 分析2012 年4 月至2013 年7 月在我院接受住院治疗的RHD 患者的临床资料。所有RHD 患者均需经心脏彩超以及术后瓣膜检查的确诊，并符合纽约心脏病协会制定的心功能Ⅱ～Ⅳ级标准。排除肾、肝功能不全者，冠心病患者，炎症性疾病和急慢性感染患者，恶性肿瘤和脑血管疾病、低氧患者，内分泌疾病患者，近期服用相关调节免疫的药物和出现风湿活动的患有风湿性疾病的患者，其他自身免疫疾病患者等。将所有RHD 患者作为观察组，共纳入40 例患者，其中，男性患者为28 例，女性患者为12 例，患者的平均年龄为(51.4±7.5)岁;而对照组是从我院的体检中心选取的健康体检人员，共纳入36 例，其中，男性26 例，女性10 例，平均年龄为(51.3±9.3)岁，通过比较发现两组的性别、年龄差异不具有统计学意义。

1.2 研究方法 主要试剂:购自美国Biolegend 公司的APC-Foxp3 抗体(包括配套的破膜液)、PECD25 抗体、FITC-CD4 抗体，购自美国R＆D 公司的人TGF-β1 ELISA 试剂盒与人IL-10ELISA 试剂盒，1640 培养液，2%冰乙酸，0.9%生理盐水和淋巴细胞分离液。

主要仪器:购自美国Beckman Coulter 公司的FC 500 型流式细胞仪，购自北京普朗新技术有限公司的DNX-9620 型自动洗板机，购自上海沪西分析仪器有限公司的WH-2 微型涡旋混合仪，恒温箱，低温冰箱，EP 管，微量吸管，Tip 头及吸头盒，微量加样管(10～1 000 μl，10～100 μl，2～20 μl)，15 ml的离心管，冷冻管，血细胞计数板，移液管，医用冷藏箱，高压灭菌消毒管，自动双重纯水蒸馏器，电动离心机，光学显微镜，RT-2100 型酶标仪。

1.2.1 计算细胞数目 采集两组患者的清晨空腹肘正中静脉血，共2 管，按测试要求对样本进行预处理后，用作细胞数目的计算。在100 μl 的细胞悬液中添加各20 μl 的PE-CD25 和FITC-CD4 抗体，室温下进行避光反应，1/2 h 后离心上述混合液，去除上清液，室温下滴加破膜液1 000 μl 静置1/3 h，继续添加APC-Foxp3 抗体20 μl，室温下进行避光反应，1/2 h 后用染色缓冲液进行充分冲洗，离心后采用PBS 溶液(400 μl)使细胞悬浮，最后以CD4 设门，流式细胞仪进行检测，分析CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群，并计算CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 淋巴细胞百分比。

1.2.2 酶联免疫吸附测定(ELISA)检测TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-6 浓度 室温下将试剂盒从冰箱中取出静置1/2 h，将试剂盒缓慢摇匀后打开瓶盖，为使试剂在管底集中而离心各种试剂;标准品在使用前2 h 内进行稀释处理，然后分别以100 μl 每孔将样品依次注入第一排相应的酶标孔中，盖上瓶盖后缓慢晃动让样品与板底的抗体能充分接触，3/2 h恒温处理;配制生物素抗体的工作液，参照之前的加样的顺序以100 μl 每孔依次注入酶标孔中，轻轻晃动以便板底的抗体和生物素抗体能充分接触，1 h恒温处理;再次往酶孔内注入ABC(亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)液，充分接触后1/2 h 恒温处理;准备显色剂对样品实施显色反应，获取450 nm处的吸光值，将OD 值测定，绘制标准曲线，计算TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-6 浓度。

CD4+CD25+Foxp3+细胞的测定:首先分离外周血中的PBMCs(单个核细胞)，然后将细胞浓度调整至1×106ml-1，最后对CD4+CD25+Foxp3+Terg 细胞进行染色处理。

1.3 统计学方法 本研究中的数据均采用SPSS19.0 软件进行分析。数据计量以±s 形式表示，比较采用t 检验和χ2检验。我们定义P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料 本研究共纳入受试者76 例，其中观察组患者40 例(12 例单纯二尖瓣狭窄，15 例二尖瓣关闭不全伴狭窄，13 例二尖瓣、主动脉瓣关闭不全伴狭窄)，对照组36 例。表1 可见两组患者的基线资料比较并无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 两组患者Treg 细胞比较 观察组和对照组的外周血的CD4+CD25+Treg 细胞比较详见表2，结果可见观察组患者的CD4+CD25+T 占淋巴细胞比例(t=17.37，P ＜0.01)、CD4+CD25+Foxp3+Treg 占CD4+T 比例(t=9.224，P ＜0.01)均显著低于对照组。

2.3 观察组与对照组细胞因子水平比较 观察组和对照组的细胞因子包括TGF-β1、IL-10、TNF-α、IL-6 水平详见表3，结果提示观察组患者的TGF-β1(t=9.036，P＜0.01)、IL-10(t=12.11，P＜0.01)均显著低于对照组，而TNF-α(t=2.331，P=0.013)、IL-6(t=2.239，P＜0.01)水平则高于对照组，差异均有统计学意义。

表1 观察组与对照组基线资料的比较Tab.1 Comparison of general information in observe group and control group

表2 两组患者CD4+CD25+Treg 细胞比较Tab.2 Comparison of CD4+CD25+Treg cells in two groups

表3 观察组和对照组的炎性因子比较Tab.3 Comparison of inflammatory factors in observe group and control group

3 讨论

CD4+CD25+Terg 细胞(CD4+CD25+T 细胞，CD4+CD25+调节性T 细胞)在发育、功能的发挥中，受Foxp3(转录因子)重要的调控作用，转化为CD4+CD25+Foxp3+Treg，发挥CD4+CD25+调节性T 细胞的前体是Foxp3 组成性的表达，正常状态下机体内自身抗原不与自身反应性T 细胞发生反应的主要原因是存在的CD4+CD25+Foxp3+Treg 抑制了反应性T细胞的活化。CD4+CD25+Foxp3+Treg 在自身免疫性疾病(如风湿性心脏病)中起着重要的作用，对机体内部分效应性T 细胞和自身反应性T 细胞存在的选择性抑制是形成、维持调节性T 细胞免疫自稳的一个重要机制，其运用多种机制对自身反应性的T细胞进行抑制，保持免疫耐受的状态，进而达到免疫自稳以及预防免疫性疾病出现的目的［3］。以往的研究结果发现CD4+CD25+Foxp3+Treg 能有效抑制自身免疫性疾病的出现，但是一旦CD4+CD25+Foxp3+Treg 浓度降低，患者的免疫抑制能力则会随之减弱，但是此时体液的免疫功能却有所增强，活化T细胞，产生自身抗体，这极易使自身受损进而患上自身免疫性的疾病，同时也会使致病因子进一步扩散或持续存在导致疾病的复发［4］。本研究结果显示，RHD 患者体内CD4+CD25+Foxp3+Treg 浓度明显比健康人低，提示此类患者自身的免疫抑制功能相对较弱，进而导致了如慢性风湿性心脏病等一些自身免疫疾病的出现。RHD 患者大部分病史均相对比较长，同时病情反复，考虑与CD4+CD25+Foxp3+Treg的减少以及致病因子的扩散、持续存在可能相关［5］。CD4+CD25+调节性T 细胞在抗原浓度降低时，通过细胞接触来发挥作用;在抗原浓度上升时，通过分泌TGF-β 和IL-10 等来发挥免疫的抑制作用。

IL-10 作为抗炎因子，可以对单核细胞促进特异性、天然性免疫的功能进行有效抑制，主要来源于Th 细胞和单核细胞，只要是淋巴细胞基本都能合成IL-10［6］。本实验结果显示，IL-10 在RHD 患者的血清中的浓度明显比正常对照组低，提示在心脏瓣膜出现自身免疫疾病的时候，由于IL-10 水平的下降，会致使体内自身抗体以及多种炎性因子的合成有所增加且长期持续存在，在自身抗体的免疫持续攻击中以及炎性因子长期的局部修复与受损过程中，心脏瓣膜逐步开始病变，最终导致了心脏瓣膜病的发生［7］。

TGF-β1 是TGF-β 的主要表现类型，其除了可以促进成纤维细胞和成骨细胞的生长外，还能抑制淋巴细胞分化、细胞因子产生以及免疫活性细胞增殖。本实验结果显示，TGF-β1 在RHD 患者外周血清中的浓度明显比正常对照组低，提示TGF-β1 浓度出现的变化和心脏瓣膜发生的病变无关，考虑可能是由于心脏瓣膜的局部在出现慢性炎症时相应的淋巴细胞开始浸润，通过局部旁TGF-β 的分泌，TGF-β 表达上升的淋巴细胞至瓣膜及心肌组织内，最终表现为局部的TGF-β 上升同时引发了瓣膜钙化或者纤维化［8］。

通过TGF-β1 和IL-10，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞发挥重要的免疫调节作用。本研究结果发现，RHD 患者外周血中不仅CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞水平降低，TGF-β1 和IL-10 的表达水平也均有所降低。虽然尚无法确定是CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞水平的降低导致了TGF-β1 和IL-10 浓度的降低，但是可以肯定它们之间的正比例关系。故RHD 患者的免疫发生异常不仅与CD4+CD25+调节性T 细胞水平的下降有关，还与TGF-β1 和IL-10 的表达水平的降低有关［9］。

TNF-α 和IL-6 均属于促炎性因子，其中TNF-α是致使机体对创伤、手术做出代谢应答的一个重要的标志物，具有使脂蛋白酶活性降低和引发发热的作用;IL-6 具有促进急性相蛋白和免疫球蛋白合成、生成前列腺以及β 细胞增殖的作用。本研究结果显示，观察组患者的TNF-α 和IL-6 浓度明显比对照组高，提示RHD 患者体内促炎因子增多，RHD 的发生发展与TNF-α 和IL-6 浓度有关，故TNF-α 和IL-6的水平可以作为RHD 病情判断以及疗效的两项重要的观察指标。总而言之，相比于正常对照组，RHD 患者外周血中的CD4+CD25+调节性T 细胞水平有所下降，说明RHD 患者病情的发展受到了发生紊乱的免疫功能的影响［10］;TGF-β1 和IL-10 水平的变化与CD4+CD25+调节性T 细胞水平的变化显著相关，提示对RHD 患者，TGF-β1 和IL-10 的水平可以作为CD4+CD25+调节性T 细胞水平变化的两项重要的辅助指标;RHD 患者的TNF-α 和IL-6 浓度明显比健康者高，说明RHD 患者体内促炎因子明显增多，依据TNF-α 和IL-6 的水平可以判断RHD 的病情和治疗效果。

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［10］Fae KC，Palacios SA，Nogueira LG，et al.CXCL9/Mig mediates T cells recruitment to valvular tissue lesions of chronic rheumatic heart disease patients［J］.Inflammation，2013，36(4):800-811.