风湿性心脏病患者瓣膜组织自身抗原变化与IL-10、TGF-β1 血清浓度变化之间的关系

黄刚哲 金勇男 (延边大学附属医院老年病科，延吉 133000)

风湿性心脏病(RHD)是由甲组乙型溶血性链球菌感染引起变态反应(风湿热)的后遗症，属自身免疫性疾病［1］。常见发生病理变化的部位是心脏瓣膜，二尖瓣为最常见受累部位［2］。TGF-β1 通过自身信号通路的调节能够影响多种生命活动，包括细胞生长、增殖、凋亡等。IL-10 是近几年新发现的细胞因子，具有抑制多种炎性分子及自身抗体合成的功效。TGF-β1 信号通路通过促进上皮间质转化，调控基因的表达，从而发挥生物学效应。我们通过筛选发现血清IL-10、TGF-β1 浓度与风湿性心脏病患者瓣膜组织自身抗原间可能存在异常关系。我们通过构建噬菌体展示文库筛选自身抗原的异常表达，并通过一系列外周血标志性物质比例和浓度的比较，分析其与RHD 之间存在的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 选取2008 年到2013 年我院心内科收治的通过24 h 动态心电图及超声心动图检测确诊为风湿性心脏病的63 例患者作为实验组，NY-HA 评级2～4 级，实验组患者共计63 例，其中男性27 例，平均年龄(48.2±11.3)岁;女性36 例，平均年龄(52.1±9.8)岁。对照组患者为我院体检中心随机筛选出来的63 位健康志愿者，其中男性27 例，平均年龄(48.2±10.4)岁;女性36 例，平均年龄(52.1±8.9)岁。实验组和对照组在年龄、性别等中无统计学意义，具有可比性。实验开始前对实验组和对照组患者均进行提前告知并进行相关介绍，征得患者及家属同意后开始试验。纳入标准:经冠脉CT、X 光透视和肝功肾功检测、癌胚检测、血常规检查排除存在冠心病、肺功能异常、肝肾功能不全、肿瘤、其他炎性感染性疾病和糖尿病、甲亢甲减等内分泌疾病的存在。询问近期药物使用情况，确定患者无服用免疫调节剂。询问病史，确定一月内无其他自身免疫性疾病的发生。

排除标准:排除存在冠状动脉异常，肝、肾功能异常、存在恶性肿瘤及存在感染性和内分泌系统疾病的患者，对使用影响试验的药物的患者和存在其他自身免疫性疾病的患者，向患者和家属解释清楚后，排除出实验组。

1.1.2 主要材料及试剂 实验组及对照组均取抗凝血标本5 ml×2 管，上海研晶生化试剂有限公司生产的鼠抗人CD4-FITC 荧光抗体(克隆:mPC-13);武汉科昊佳生物科技有限公司生产的鼠抗人CD25-PE(克隆:mPC-19);上海北诺生物科技有限公司分装的eBioscince 公司生产的Anti-Human Foxp3 APC 100 testsebioscience 试剂盒。安迪生物科技(上海)有限公司销售的R＆D IL-10 和TGF-β1 酶联免疫试剂盒。北京索莱宝科技有限公司生产的R1200 总RNA 提取试剂盒;北京雅安达生物技术有限公司生产的RNeasy Plus Mini Kit(250)74136 qiagen 试剂盒;Clontech 公司生产的SMARTTMcDNA Library Construction Kit 试剂盒以及马克西姆公司生产的PCR 反应试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 患者心肌组织噬菌体展示文库的构建与自身抗原RHDAG1 的获得与鉴定 两组间所有对象均取新鲜心耳组织保存于样本保护液中，液氮下手工研钵制备组织匀浆，进行心肌组织总RNA 提取。参照SMARTTMcDNA Library Construction Kit 试剂盒构建心肌组织噬菌体展示文库［3］。对文库进行包装和鉴定后进行文库免疫筛选，并对自身抗原编码基因进行分析，确定相关自身免疫抗原。对自身抗原基因表达载体进行构建并进行体外表达和免疫性试验。

1.2.2 血样标本的处理及使用 实验组及对照组的5 ml×2 管抗凝血标本，一管5 000 r/min×3 min离心后取血清进行酶联免疫吸附法进行对IL-10、TGF-β1 血清浓度的检测。另一管进行外周血单核细胞(PBMC)的分离。将样本细胞浓度稀释至106级别/ml。取样20 μl 加入相关试剂盒，再分别取CD4-FITC 25 μl、CD25-PE 25 μl 加入，37℃避光保存30 min，5 000 r/min×3 min 离心弃上清。加入试剂盒相应固定一裂解液3 ml 37℃避光反应30 min。反应完毕后加入Foxp3-APC 30 μl 37℃避光反应30 min，PBS 洗涤、离心，使用流式细胞检测仪检测，CD4 设门，分析相应CD4+CD25+Foxp3+亚群，每份标记1 万个细胞，以CD4+CD25+Foxp3+-Treg/CD4+T淋巴细胞的比例表示。

1.3 统计学方法 样本资料采用PEMS 3.1 软件处理。资料采用t 检验，以P＜0.05 具有统计学意义，P＜0.01 具有显著意义。

2 结果

2.1 对RHD 患者瓣膜组织自身抗原变化的比较将文库制成双层琼脂板，37℃恒温培养4.5 h，10 mmol/L IPTG 润洗覆盖培养6 h，标记后取膜，脱脂奶粉4℃封闭培养10 h，抗血清37℃杂交结合2 h后洗膜3 次，多次杂交后选取阳性板继续筛选，经多次筛选得出三种疑似与RHD 相关的瓣膜组织自身抗原，分别是THYN1V1、THYN1V2、RHDAG1 三种，通过与对照组患者的比较，发现RHDAG1 与对照组间具有明显的差异，且将体外表达的RHDAG1 与3例风湿热患者、5 例RHD 患者和5 例健康志愿者的血清分别进行结合反应试验，发现RHDAG1 与风湿热和RHD 患者血清出现结合，与健康志愿者血清不结合，这提示RHDAG1 可能与风湿热及风湿性心脏病的发展有关，结果见表1。

2.2 两组间外周血调节性T 细胞比例的比较 我们对两组实验对象的血样处理后，使用流式细胞检测仪检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞的比例并进行比较，提示RHD 患者血清Treg 比例低于对照组的相关数据，具有统计学差异。结果见表2。

2.2 两组间IL-10、TGF-β1 血清浓度的比较 我们对血样离心后取血清酶联免疫吸附法检测IL-10、TGF-β1 血清浓度，结果显示TGF-β1 的上升可以使Treg 中Foxp3 表达出现上升，使CD4+CD25+Foxp3+细胞数量上升，两组间IL-10、TGF-β1 血清浓度的比较具有差异性，CD4+CD25+Foxp3+T 细胞与IL-10、TGF-β1 的变化正相关。结果见表3。

表1 瓣膜组织自身抗原变化的比较Tab.1 Comparison of valvular tissue autoantigen changes

表2 两组间外周血调节性T 细胞比例的比较Tab.2 Comparison peripheral regulatory T cell percentage of between two groups

表3 两组间IL-10、TGF-β1 血清浓度的比较Tab.3 Comparison of IL-10，TGF-β1 serum concentration between two groups

3 讨论

风湿性心脏病是一种最典型的人类自身免疫性疾病，因为人体心肌组织与甲组乙型溶血性链球菌表面抗原相似，在甲组乙型溶血性链球菌感染后机体产生相应抗体，诱发免疫反应，在甲组乙型溶血性链球菌被消灭后继续与人体组织蛋白产生交叉识别，导致人体免疫系统出现识别错误进而导致自身免疫疾病的发生。甲组乙型溶血性链球菌细胞壁表面含有多糖及多种表面蛋白(M、T、R 等)［4］。在人体组织中诸如心肌球蛋白、原肌球蛋白以及多种瓣膜蛋白上均有M 蛋白的身影，M 蛋白作为甲组乙型溶血性链球菌最重要的抗原结构，由于与体内多种表面蛋白的交叉，构成了人体对链球菌耐受和自身免疫反应的分子基础。

我们通过寻找能够引起RHD 发生自身免疫反应的抗原，希望能为RHD 的研究找到一条新路。通过构建心肌组织噬菌体展示文库，对文库进行鉴定和免疫筛选，并对自身抗原编码基因进行分析，最终确定三组疑似与RHD 相关的瓣膜组织自身抗原，分别是THYN1V1、THYN1V2、RHDAG1 三种，通过与对照组患者的比较，发现RHDAG1 与对照组间具有明显的差异。将在体外通过质粒转录表达的RHDAG1 与3 例风湿热患者、5 例RHD 患者和5 例健康志愿者的血清分别进行结合反应试验，发现RHDAG1 与风湿热和RHD 患者血清出现结合，与健康志愿者血清不结合，这提示RHDAG1 可能与风湿热及风湿性心脏病的发展有关。我们通过对组织展示文库的构建和与相关样本的血清进行结合反应阐释了交叉抗原RHDAG1 与RHD 之间相关联的直接证据。

各实验样本血样经处理后使用流式细胞检测仪检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞的比例，各组结果进行比较，提示RHD 患者血清Treg 比例低于对照组样本中的相关数据，具有统计学差异。有研究显示Treg 细胞有抑制自身免疫疾病发生的功效［5］。当CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞数量减少时，患者免疫功能下降，促使B 淋巴细胞产生一定数量的自身抗体，极易发生自身免疫性损伤。鉴于这种抗体会随血液循环进行扩散，造成了无法清除和长时间持续存在的影响，容易引起疾病的复发［6］。通过临床跟踪我们也可发现，RHD 患者体内Treg 细胞低于正常水平，且大部分患者病史长，出现病情反复，这也说明与抗体的无法清除和长时间持续有关。心肌组织通过长时间的抗击自身抗体的攻击，最终会导致瓣膜部位发生病变，导致严重的病理后果。

IL-10 是近几年新发现的细胞因子，又称细胞素合成抑制因子［7］。具有抑制多种炎性分子及自身抗体合成的功效［8］。转化生长因子-β(TGF-β)目前共发现三种类型，分别为TGF-β1、TGF-β2 和TGFβ3。TGF-β1 由体内单核细胞、树突状细胞分泌，在RHD 中表达增强，提示可能与瓣膜纤维化有关［9］。TGF-β1 的上升可以使Treg 中Foxp3 表达升高，使CD4+CD25+Foxp3+细胞数量上升，这也印证了实验中两组间外周血调节性T 细胞比例较RHD 患者CD4+CD25+Foxp3+-Treg/CD4+T 细胞的比例明显低于对照组健康志愿者的比例。抗凝血标本离心后取血清进行ELISA，检测IL-10、TGF-β1 血清浓度，结果显示两组间IL-10、TGF-β1 血清的浓度间的比较均具有明显的差异性。

综上所述，自身抗原RHDAG1 的表达对RHD的进展有一定作用，检测外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞的比例和IL-10、TGF-β1 血清浓度对于RHD 的诊断具有重要意义。

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