水浴降温与室温降温对热打击大鼠肺组织损伤及预后影响比较

杨文超，高铁婴，胡 婕，李瑞生，宋 青解放军总医院 重症医学科，北京 00853；解放军第30医院 动物实验中心，北京 00039

基础研究论著

水浴降温与室温降温对热打击大鼠肺组织损伤及预后影响比较

杨文超1，高铁婴1，胡 婕1，李瑞生2，宋 青1
1解放军总医院 重症医学科，北京 100853；2解放军第302医院 动物实验中心，北京 100039

目的研究冰水浴、常温水浴、室温降温对热打击(heat stress，HS)大鼠死亡构成比、肺组织病理及相关细胞因子水平的影响。方法115只雄性SD大鼠随机分为肺损伤观察组(n=70)和死亡率分析组(n=45)。肺损伤观察组随机分为空白对照(normothermic contral，NC)组(n=10)和热打击(room temperature，RT)组(n=60)，NC组始终置于室温环境，HS组大鼠麻醉后置于高温高湿模拟环境，核心体温达42℃后，随机分为室温降温组(n=20)，常温水浴降温(temperate-water immersion，TWI)组(n=20)，冰水浴降温(ice water immersion，IWI)组(n=20)，分别给予相应降温方法降温。同时，将3组大鼠分别随机分为热打击后15 min处死组(n=10)和3 h处死组(n=10)。各组大鼠在相应时间点处死，HE染色观察肺组织病理改变，Elisa检测肺组织匀浆相关细胞因子水平。死亡率分析组随机分为HS + RT组、HS + TWI组、HS + IWI组，统计热打击后3 h死亡构成比。结果与HS + RT组相比，HS + TWI组和HS + IWI组大鼠死亡构成比显著降低(χ2=10.601，P=0.001)。HS + IWI 3 h组肺组织出现间质水肿、出血，肺泡萎缩塌陷、腔内出血，促炎因子TNF-α水平高于NC组(P＜0.05)及对应TWI组、RT组(P＜0.05)。结论TWI、IWI较RT显著改善热打击大鼠预后，但IWI诱发更为严重的肺组织损伤，提示目前的水浴温度、水浴时长等可能不是最优的。

热打击；冰水浴降温；肺；炎症；大鼠

热射病是机体暴露在高温、高湿环境中，核心体温(core temperature，Tc)迅速升高(通常＞40℃)伴中枢神经系统症状为主要特征的致命性急症，发病后迅速出现全身炎性反应及多器官功能障碍[1-3]，病死率可达40%[4]。75%热射病患者合并多器官功能障碍，其中87.5%出现呼吸衰竭，主要表现为急性呼吸窘迫综合征[3,5]。动物实验证明，热打击(heat stress，HS)后大鼠肺组织出现急性炎症反应[3,6-7]。迅速降温和器官功能支持是热射病的两个主要治疗原则[1]。将体温在30 min内降至40℃以下至关重要，为热射病治疗的“黄金半小时”。快速降温的金标准为冷水浴降温(cold water immersion，CWI)(1.7～14.0℃)，其中4℃以下水浴降温又称冰水浴降温(ice water immersion，IWI)。临床上也有使用常温水浴降温(temperate-water immersion，TWI)(20～26℃)的报道[8]。但水浴降温对热打击后肺组织损伤的影响国内外尚无详尽报道。本实验通过比较冰水浴、常温水浴、室温降温对热打击大鼠死亡构成比、肺组织病理及相关细胞因子水平的影响，探讨水浴降温对热打击致急性肺损伤的作用效果。

材料和方法

1 实验动物 健康雄性Sprague-Dwley大鼠115只，12～14周龄，体质量(210±20) g，SPF级，由解放军第302医院提供。分笼适应性饲养3 d(动物合格证书编号：军动管字第2014022191号)，温度(23±1)℃，湿度40%±5%，灯光照明，12 h昼夜节律变化。遵守实验动物伦理原则，关注动物福利，尽可能减少对动物的损害。

2 主要仪器和试剂 自制热环境仿真模拟舱，动物肛温表，定时秒表，控温毯，离心机，电动匀浆器，生物组织包埋机，组织切片机，EP管。4%多聚甲醛，二甲苯，无水乙醇，95%、85%、75%及60%乙醇，蒸馏水，苏木精染液，伊红染液，PBS液，苯甲基磺酰氟，BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime)，ELISA检测试剂盒(NeoBioscience)：转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)(ERC107b.96)，白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)(ERC004.96)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)(ERC102a.96)，IL-6 (ERC003.96)。

3 实验分组与热打击模型制备 实验前12 h禁食不禁水，实验动物按随机数字表法随机分为肺损伤观察组(n=70)和死亡率分析组(n=45)。肺损伤观察组再随机分为空白对照(normothermic control，NC)组(n=10)和HS组(n=60)，NC组始终置于室温环境[温度(23±1)℃，湿度40%±5%]。HS组大鼠10%水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉后，俯卧置于温度(37.5±0.5)℃、湿度65%±5%的模拟环境[9-10]，核心体温达到42℃建立热打击模型后[11]，从模拟环境中取出并随机分为3组，立即使用相应降温方法进行降温：室温降温(room temperature，RT)组(n=20)置于室温降温，TWI组(n=20)置于(21±1)℃水浴降温，IWI(n=20)置于(3±1)℃水浴降温，降至热打击前核心体温后使用控温毯维持体温。同时，将3组大鼠分别随机分为热打击后15 min处死组和3 h处死组两个亚组，记为HS + RT 15 min组(n=10)，HS + RT 3 h组(n=10)，HS + TWI 15 min组(n=10)，HS + TWI 3 h组(n=10)，HS + IWI 15 min组(n=10)，HS + IWI 3 h组(n=10)。死亡率分析组随机分为HS + RT组(n=15)、HS + TWI组(n=15)、HS + IWI组(n=15)，造模及降温方法同上，观察热打击后3 h大鼠存活情况并统计死亡构成比。

4 核心体温监测 使用动物肛温表测量肛温作为核心体温(℃)，Tc＜41℃时，每15 min测量1次；Tc＞41℃时，每5 min测量1次，直至造模成功，记录造模时间(min)。计算各降温方法降温速率(υ，℃/min)，IWI及TWI公式：

5 HE染色 各组大鼠均在10%水合氯醛麻醉下颈动脉取血处死，取左肺于4%多聚甲醛灌注固定。切取3 mm×3 mm×2 mm组织块，60%乙醇过夜、75%乙醇50 min、85%乙醇50 min、95%乙醇50 min、无水乙醇50 min (2次)脱水。二甲苯30 min (2次)透明，65℃恒温下浸蜡20 min (2次)。包埋后行5μm切片，而后行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察并照相。

6 肺组织TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β检测剪取适量右肺下叶同一区域组织至2 ml EP管，加入500μl遇冷PBS，加至终浓度为1 mmol/L的苯甲基磺酰氟，电动匀浆器匀浆10 s×3次，冰上放置20 min，4℃、15 000 r/min离心20 min。离心后，收集上清液，BCA蛋白定量测定各样本蛋白浓度，用PBS将各样本蛋白调整为蛋白浓度一致(5 mg/ ml)，Elisa检测TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β浓度。

结 果

1 热打击模型大鼠一般情况 各组大鼠体质量、造模前Tc、造模成功Tc、造模时间差异均无统计学意义。HS + TWI 15 min组、HS + IWI 15 min组均在热打击后15 min内降至热打击前Tc(υTWI=0.34± 0.04，υIWI=0.55±0.06)，而HS + RT 15 min组在处死时未能降至热打击前Tc(υRT=0.14±0.05)。IWI降温速率大于TWI(P＜0.05)，TWI降温速率大于RT(P＜0.05)。见表1。

2 肺组织病理 HS + RT 15 min组、HS + RT 3 h组、HS + TWI 15 min组、HS + TWI 3 h组、HS + IWI 15 min组出现肺间质毛细血管扩张、间质增宽；HS + IWI 3 h组可见肺间质增宽、水肿、出血，肺泡萎缩塌陷、腔内出血。各组均未见明显的中性粒细胞浸润。见图1。

3 肺组织TGF-β、IL-10变化 HS + RT 15 min组、HS + TWI 15 min组、HS + IWI 15 min组TGF-β、IL-10水平高于NC组(P＜0.05)；HS + TWI 15 min组、HS + IWI 15 min组TGF-β、IL-10水平低于HS + RT 15 min组(P＜0.05)；HS + IWI 15 min组TGF-β、IL-10水平高于HS + TWI 15 min组(P＜0.05)。HS + RT 3 h组、HS + TWI 3 h组、HS + IWI 3 h组TGF-β、IL-10水平低于NC组(P＜0.05)及其对应15 min组(P＜0.05)；HS + TWI 3 h组、HS + IWI 3 h组TGF-β、IL-10水平高于HS + RT 3 h组(P＜0.05)；HS + IWI 3 h组TGF-β水平高于HS + TWI 3 h组(P＜0.05)；HS + IWI 3 h组IL-10水平低于HS + TWI 3 h组(P＜0.05)。见图2。4 肺组织TNF-α、IL-6水平变化 HS + TWI 15 min组、HS + IWI 15 min组TNF-α水平高于NC组和HS + RT 15 min组(P＜0.05)；HS + IWI 15 min组高于HS + TWI 15 min组(P＜0.05)；HS + RT 15 min组与NC组TNF-α水平差异无统计学意义(P＞0.05)。HS + RT 3 h组、HS + TWI 3 h组、HS + IWI 3 h组TNF-α水平高于NC组(P＜0.05)及相应15 min组(P＜0.05)；HS + TWI 3 h组、HS + IWI 3 h组高于HS + RT 3 h组(P＜0.05)；HS + IWI 3 h组高于HS + TWI 3 h组(P＜0.05)。各组IL-6水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图 1 各组大鼠肺组织病理改变 (HE×800)Fig. 1 Histological examination of lung tissues of rats in each group (HE×800)

表1 各组大鼠体质量、核心体温、造模时间、降温速率比较Tab. 1 Comparison of weight, Tc, time of HS, cooling rate of rats in each group (±s)

表1 各组大鼠体质量、核心体温、造模时间、降温速率比较Tab. 1 Comparison of weight, Tc, time of HS, cooling rate of rats in each group (±s)

Tc: core temperature; υ: cooling rate; NC: normothermic control; HS: heat stress; RT: room temperature; TWI: temperate-water immersion; IWI: ice water immersion; 15 min: 15 minutes after heat stress; 3 h: 3 hours after heat stress.aP＜0.05, vs HS + RT;bP＜0.05, vs HS + TWI

图 2 水浴降温对大鼠肺组织TGF-β、 IL-10、 TNF-α、 IL-6的影响Fig. 2 Effects of water immersion on TGF-β, IL-10, TNF-α, IL-6 levels in lung homogenate HS: heat stress; RT: Room temperature; TWI: Temperate-water immersion; IWI: Ice-water immersion; NC: normothermic control; 15 min: 15 minutes after heat stress; 3 h: 3 hours after heat stress.aP＜0.05, vs NC;bP＜0.05, vs HS + RT at the same time point (15 min or 3h);cP＜0.05, vs HS + TWI at the same time point;dP＜0.05, vs 15 min with the same cooling treatment (RT; TWI; or IWI)

5 各降温方法死亡构成比比较 热打击后3 h，HS + RT组大鼠死亡6只，死亡构成比40%，死亡大鼠口唇、舌、鼻尖及四肢末端紫绀。HS + TWI组、HS + IWI组均无大鼠死亡，合并记为HS + WI组，死亡构成比为0，与HS + RT组比较差异有统计学意义(χ2=10.601，P=0.001)。见表2。

表2 各降温方法大鼠死亡构成比比较Tab. 2 Constituent ratio of death of rats in different cooling treatments (n, %)

讨 论

目前认为，决定热射病预后最重要的因素为体温高于危险极值的时长，体温在30 min内降至40℃以下的患者均可存活[8,12]。有研究表明，CWI(1.7～14.0℃)可在20 min内将体温(＞43.3℃)降至40℃以下[13]。本实验中，与RT组相比，TWI及IWI降温速率增大，且IWI更为明显；同时，TWI和IWI显著降低热打击大鼠死亡构成比。

TGF-β和IL-10与肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)表面TGF-β受体和IL-10受体结合，抑制AM释放促炎介质TNF-α、IL-6等[14]。本实验中，RT、TWI、IWI 15 min组肺组织TGF-β、IL-10水平较NC组显著升高，RT、TWI、IWI 3 h组肺组织TGF-β、IL-10水平均较其对应15 min组及NC组显著降低，提示随着病情发展，各降温组TGF-β和IL-10对AM的抑制作用减弱。HS + IWI 3 h组肺组织TNF-α水平高于HS + TWI 3 h组和HS + RT 3 h组，且出现肺间质水肿、出血，肺泡萎缩塌陷及腔内出血，故IWI诱发热打击大鼠肺部更为严重的组织损伤。然而，Yang等[15]建立大鼠热打击模型，环境温度16℃持续降温2 h的方法观察肺损伤发现，该方法可缓解热打击致肺泡塌陷、间质增宽及炎性细胞浸润；热打击后88 min，与常温环境组(26℃)相比，支气管肺泡灌洗液促炎因子TNF-α水平显著降低。本实验结果与之相反，可能为降温过度所致。此外，本实验各组大鼠肺组织IL-6水平均未出现明显变化，可能与AM分泌特性及实验终点时间选取较早有关[16-17]，具体机制还需进一步研究。

目前，关于热射病救治“金标准”水浴降温治疗尚存争议。Gagnon等[18]建议使用2℃水浴将患者直肠温度降至38.6℃后停止降温。然而，机体突然浸入冰水后，皮肤温度迅速下降，诱发“冷休克”反应，在核心体温未发生变化之前出现吸气性呼吸困难、过度通气、低碳酸血症、心动过速、外周血管收缩及高血压[19]。Taylor等[20]对运动后高热患者进行水浴降温研究发现，TWI(26℃)可以减弱CWI(14℃)出现的冷休克反应。本实验中TWI和IWI均使热打击大鼠死亡构成比降为0，但热打击后3 h，IWI组肺组织促炎因子TNF-α水平高于TWI组及RT组，并出现明显间质水肿、出血，肺泡萎缩塌陷、腔内出血，提示IWI在改善热打击大鼠预后的同时参与热打击早期急性肺损伤发生、发展过程，可能与水浴温度低和(或)降温时间长，机体出现冷应激有关；此外，TWI组肺组织促炎因子TNF-α、IL-10水平高于RT组，提示TWI亦可加重肺部炎性反应，因此确定最优水浴温度、水浴时长并选取最优降温截点核心体温的研究有待完善。

本实验首次报道冰水浴降温加重热打击大鼠肺局部组织损伤，参与热打击早期急性肺损伤发生、发展过程。然而，实验中仅观察热打击前期死亡情况，而肺组织的损伤是否与后期病死率相关，还需进一步观察。此外，动物实验并不能完全代替临床实际，热射病发病早期关于冷水浴降温，尤其是冰水浴降温对肺组织甚至其他脏器影响的研究任重道远。

1 宋青.热射病，致命的中暑［J］.军医进修学院学报，2008，29（6）：453-454.

2 Leon LR， Helwig BG. Heat stroke： Role of the systemic inflammatory response［J］. J Appl Physiol， 2010， 109（6）： 1980-1988.

3 Wu WS， Chou MT， Chao CM， et al. Melatonin reduces acute lung inflammation， edema， and hemorrhage in heatstroke rats［J］. Acta Pharmacol Sin， 2012， 33（6）： 775-782.

4 刘志锋，唐柚青，徐秋林，等.热打击后小鼠肺和脑组织病理学的改变［J］.中华急诊医学杂志，2011，20（6）：623-626.

5 Varghese GM， John G， Thomas K， et al. Predictors of multi-organ dysfunction in heatstroke［J］. Emerg Med J， 2005， 22（3）： 185-187.

6 Chang CH， Kao CH， Chio CC， et al. Attenuating heatstroke-induced acute lung inflammation， edema， and injury in rats by exercise preconditioning［J］. J Trauma Acute Care Surg， 2013， 74（4）：1052-1059.

7 Yang HH， Hou CC， Lin MT， et al. Attenuating heat-induced acute lung inflammation and injury by dextromethorphan in rats［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2012， 46（3）： 407-413.

8 Casa DJ， Armstrong LE， Kenny GP， et al. Exertional heat stroke：new concepts regarding cause and care［J］. Curr Sports Med Rep，2012， 11（3）： 115-123.

9 陈洁坤，宋青，李瑞生，等.肝素对劳力型热射病大鼠模型早期干预的作用［J］.军医进修学院学报，2014，35（5）：470-473.

10 张婷，宋青，周飞虎，等.经典型与劳力性热射病动物模型之比较［J］.解放军医学院学报，2013，34（12）：1209-1212.

11 Lord PF， Kapp DS， Hayes T， et al. Production of systemic hyperthermia in the rat［J］. Eur J Cancer Clin Oncol， 1984， 20（8）：1079-1085.

12 Casa DJ， Kenny GP， Taylor NA. Immersion treatment for exertional hyperthermia： cold or temperate water?［J］. Med Sci Sports Exerc，2010， 42（7）： 1246-1252.

13 Casa DJ， Mcdermott BP， Lee EC， et al. Cold water immersion： the Gold standard for exertional heatstroke treatment［J］. Exerc Sport Sci Rev， 2007， 35（3）： 141-149.

14 Hussell T， Bell TJ. Alveolar macrophages： plasticity in a tissuespecific context［J］. Nat Rev Immunol， 2014， 14（2）： 81-93.

15 Yang HH， Chang CP， Cheng RT， et al. Attenuation of acute lung inflammation and injury by whole body cooling in a rat heatstroke model［J/OL］. http：//www.hindawi.com/journals/ bmri/2009/768086

16 钟梓文.急性肺损伤时白细胞介素10在肺泡巨噬细胞中的表达［J］.医学综述，2013，19（9）：1555-1558.

17 Leon LR， Dineen S， Blaha MD， et al. Attenuated thermoregulatory，metabolic， and liver acute phase protein response to heat stroke in TNF receptor knockout mice［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2013， 305（12）： R1421-R1432.

18 Gagnon D， Lemire BB， Casa DJ， et al. Cold-water immersion and the treatment of hyperthermia： using 38.6°C as a safe rectal temperature cooling limit［J］. J Athl Train， 2010， 45（5）： 439-444.

19 Datta A， Tipton M. Respiratory responses to cold water immersion：neural pathways， interactions， and clinical Consequences awake and asleep［J］. J Appl Physiol （1985）， 2006， 100（6）： 2057-2064.

20 Taylor NA， Caldwell JN， Van den Heuvel AM， et al. To cool， but not too cool： that is the question--immersion cooling for hyperthermia［J］. Med Sci Sports Exerc， 2008， 40（11）：1962-1969.

Comparison of effects and prognosis of ice water immersion and room temperature cooling treatments on lung inflammation in heat-induced rats

YANG Wenchao1, GAO Tieying1, HU Jie1, LI Ruisheng2, SONG Qing1
1Department of Critical Care Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Laboratory Animal Center, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China

SONG Qing. Email: songqing3010301@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of ice water immersion, temperate-water immersion, and room temperature cooling treatments on constituent ratio of death, histology and related molecules in lungs of heat-induced rats.MethodsOne hundred and fifteen male SD rats were randomly divided into pulmonary injury-analyses group (n=70) and death-analyses group (n=45), and the former group included two groups: normothermic control group (NC, n=10) and heat stress group (HS, n=60). Rats in NC group were put in the room temperature chamber while rats in HS group were put in a folded heating pad with general anesthesia. When their core temperature (Tc) elevated to 42℃, cooling treatments were accomplished via room temperature (RT, n=20), temperatewater immersion (TWI, n=20) and ice water immersion (IWI, n=20). The heated rats in each group were sacrificed at the time of 15 min (n=10) or 3 h (n=10) after heat stress. The lung morphology was analyzed by hematoxylin and eosin staining, and the levels of related cytokines of the lung homogenate were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. The constituent ratio of death in the death-analyses group was calculated 3 h after heat stress in HS+RT group (n=15), HS+TWI group (n=15), and HS+IWI group (n=15).ResultsCompared with HS+RT group, the constituent ratio of death in HS+TWI group and HS+IWI group decreased significantly (χ2=10.601, P=0.001). The heated rats in HS+IWI 3 h group displayed alveolar collapse, edema, hemorrhage and thickened interstitium, and the level of the pre-inflamatory cytokine TNF-α was higher than that of the NC group (P＜0.05) and the related TWI and RT groups (P＜0.05).ConclusionTWI and IWI can improve the prognosis of heat-induced rats, while IWI may aggravate the pulmonary inflammation and cause acute lung injury after heat stress, which suggests that it is necessary to redefine the cooling temperature and cooling time of water immersion.

heat stress; ice water immersion; lung; inflammation; rats

R 594.12

A

2095-5227(2015)03-0262-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.03.017

时间：2014-11-06 10:44

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141106.1044.003.html

2014-09-03

国家自然科学基金项目(81050005)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81050005)

杨文超，女，在读硕士。研究方向：重症医学。Email: wenchao66397@163.com

宋青，女，主任医师，博士生导师。Email: songqing3010301@sina.com