大鼠脑梗死模型神经行为学评价的可靠性探讨*

西安交通大学第二附属医院老年神经科(西安710004) 王 辉 王 蓉 何 娅 陈松盛

大鼠脑梗死模型神经行为学评价的可靠性探讨*

西安交通大学第二附属医院老年神经科(西安710004) 王 辉 王 蓉▲何 娅 陈松盛

目的：探讨大鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO)神经行为学评价的可靠性。方法：制备大鼠MCAO模型，清醒后即刻(D0)行神经行为学评分及MRI成像，术后24h(D1)再次行神经行为学评分,后断头取脑行TTC染色。结果：手术组12只大鼠均有程度不等的神经缺损症状，DWI显示大面积或局限性的缺血损伤区域,10只大鼠TTC染色可见程度不等的梗死病灶。相关分析提示D0时间点Longa评分、Garcia评分与根据磁共振弥散加权成像ADC图计算的缺血梗死体积均无显著相关。D1时间点Longa评分、Garcia评分与根据TTC染色计算的脑梗死体积均呈显著相关。结论：在大鼠MCAO模型超急性期神经行为学评分可靠性较差，术后24h神经行为学评分与脑梗死严重程度相关性良好。

脑梗死研究最常用的是线栓法制备的大脑中动脉阻塞模型(MCAO),大脑中动脉供血区的神经组织可能因缺血再灌注出现功能缺损，因此在研究过程中，通常借助神经行为学评分判断脑梗死后神经损伤的程度以及之后修复的程度，但是神经行为学评分是否能可靠地反应神经损伤及修复的程度？本研究通过比较大鼠大脑中动脉缺血再灌注过程中神经行为学评分与磁共振弥散成像以及病理结果之间的相关性，探讨大鼠MCAO模型神经行为学评价的可靠性。

材料与方法

1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠20只,体重280～320g之间，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。动物随机分为两组：假手术组4只,手术组16只,术前饲养1周,术前12h禁食,自由饮水。

2 模型的制备 ①术前准备：4号手术线剪段,一端浸入溶化的固体石蜡约20mm深,迅速提出,竖直悬吊晾干,令石蜡自由顺线身滴下,以保证包裹均匀，显微镜观察其头部呈均匀的椭圆小球。从线头端起19mm处修正液标记。术前称重,10%水合氯醛3.5ml/kg体重腹腔注射麻醉。②手术过程：参照Longa线栓法[1],麻醉后的大鼠仰卧位固定于鼠板上,颈部备皮消毒,正中切口,沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA,然后近心端结扎CCA、ECA,在距CCA分叉部4mm处剪一小口,将栓线插入到ICA,用眼科镊轻推栓线,插入深度在19mm左右(修正液标记处到达ECA,ICA分叉处),感觉推进有阻力时,系牢ICA及CCA远心端的备线以固定线栓。逐层缝合切口并消毒,剪短留在体外的线栓,阻断后90min缓慢拔出线栓进行再灌注。术后将大鼠保持侧卧位，60W白炽灯照射使肛温保持在 37℃左右,注意吸痰保持呼吸道通畅。假手术组除了不插入线栓,其余操作同手术组。

3 模型评估 ①神经行为学评分：均由3名观察者采取单盲法进行评分并记录,取3名观察者评分的平均值作为得分。分别在手术清醒后即刻(记作D0)、术后24h(记作D1)进行2次评分。参考 Longa等[1]的 5分制评分标准进行神经行为学评分。参考Garcia等[2]的运动感觉功能综合评分。②磁共振检查：使用 GE 3.0T超导型磁共振成像系统，选用50mm内径大鼠头线圈。行快速自旋回波序列(FSE序列)头颅T1WI、T2WI及平面回波成像(EPI序列)DWI冠状位扫描。利用ADC图计算脑缺血梗死体积。③组织病理学：评估结束后将大鼠断头取脑,将脑放入-20℃的冰箱20min使之变硬，取出后将其切成2mm厚的冠状位切片，放入1%TTC中，37℃温箱中孵育40min，取出观察,用10%福尔马林固定照相。每张切片的脑梗死体积=(该切片双面梗死面积之和/2)×层厚,将各个切片脑梗死体积相加得到脑梗死总体积。

结 果

术后24h内共有3只实验组大鼠死亡，1只假手术组大鼠麻醉意外，排除后期病理染色中发现1只实验组大鼠出现蛛网膜下腔出血，共有3只假手术组大鼠、12只手术组大鼠纳入实验。

1 神经行为学评分 见附表。1～3号为假手术组。①Longa评分结果：假手术组D0及D1两个时间点3只大鼠均未见明显的神经缺损症状。手术组D0时间点11只大鼠均可见程度不等的神经缺损症状，1只大鼠未见神经缺损症状(13号)，而相应的ADC图上却可见大面积缺血灶。手术组D1时间点有9只大鼠可见程度不等的神经缺损症状，3只未见神经缺损症状，其中2只TTC染色未见明显的梗死灶。② Garcia评分结果：假手术组D0时间点有2只大鼠可见轻微的神经缺损症状，D1时间点有1只大鼠可见轻微的神经缺损症状，但相应的ADC图及TTC染色均未见明显的缺血损伤区域。手术组D0、D1时间点12只大鼠均可见程度不等的神经缺损症状，其中2只TTC染色未见明显的梗死灶。

附表 实验大鼠的行为学评分及梗死体积

2 磁共振检查 假手术组大鼠T1WI、T2WI、DWI均未见明显的缺血损伤区域。手术组有7只大鼠可见较大面积的缺血损伤区域，其余5只大鼠可见缺血局限于丘脑、尾状核或皮层下。

3 TTC病理染色 3只假手术组大鼠均未见脑梗死灶。手术组有10只大鼠TTC染色可见程度不等的脑梗病灶，2只大鼠未见梗死灶。

4 脑缺血梗死体积与神经行为学相关性评价 D0时间点根据ADC图计算的缺血梗死体积与D1时间点根据TTC染色计算的梗死体积明显相关(r=0.820)。D0时间点Longa评分与根据ADC图计算的缺血梗死体积无显著相关(r=0.289)，Garcia评分与根据ADC图计算的缺血梗死体积也无显著相关(r=-0.730)(图1)。D1时间点Longa评分与根据TTC染色计算的梗死体积显著相关(r=0.821)，Garcia评分与根据TTC染色显示的梗死体积也呈显著负相关(r=-0.829)(图2)。

图1 手术组大鼠D0时间点Longa评分、Garcia评分与根据ADC图计算的缺血梗死体积的散点图

图2 手术组大鼠D1时间点Longa评分、Garcia评分与根据TTC染色计算的梗死体积的散点图

讨 论

线栓法制备的大鼠MCAO模型是脑梗死研究中最常用的动物模型,多数研究者运用神经行为学方法对大鼠MCAO模型进行评价,作为判断模型是否成功以及干预是否有效的依据之一。Bederson等[3]认为,大鼠MCAO造模后24h,神经行为学评分与大面积脑梗死的梗死体积相关,但与局限于尾状核和皮层下的局限性脑梗死的梗死体积无明显相关性。Rogers等[4]发现,在60min大脑中动脉阻塞和永久性大脑中动脉阻塞两组动物模型中，尽管脑梗死体积有显著差别，神经功能评分却没有明显的差异。Chauveau等[5]研究认为在脑梗死的急性期神经行为学评分不能用于判断脑梗死的严重程度。

本研究中也发现了大鼠神经功能评分与病理结果不一致的情况,D0时间点第13号大鼠Longa评分为0，Garcia评分为14分,而DWI及TTC染色均提示大面积脑梗死。相关分析也显示,D0时间点,神经行为学评分与脑梗死体积无明显相关。D1时间点神经行为学评分与脑梗死体积显著相关。

脑梗死超急性期神经行为学评分与病理的不一致,考虑可能的原因有：①MCAO手术过程中一部分线栓未能经颈内动脉足够深入以阻断大脑中动脉血流时，由于颈内动脉的分支脉络膜前动脉被阻塞也能够引起神经功能的改变，此时神经功能评分的可靠性受到干扰；②手术过程中线栓反复操作刺激血管内膜导致短暂性脑缺血发作；③而同样为颈内动脉分支的下丘脑动脉供血区梗死可以表现为无或有轻度姿势反射异常；④除了皮质损害，重要的皮质下结构( 尤其是纤维传导束所经过的结构) 受损同样能够出现神经功能的异常；⑤急性期缺血半暗带的存在，加大了行为学与病理不一致的可能；⑥简单的神经行为学评分标准主要侧重于运动功能的检查，不能全面地反应神经损伤的程度。在本研究中，D0时间点Longa评分与根据ADC图计算的缺血梗死体积无相关，Garcia评分则与其有较弱的相关性。

MRI 具有空间分辨率高、软组织显像好等优势，是临床诊断脑梗死最常用的影像学技术，能够准确定位活体缺血发生的部位，而其中DWI序列能准确清晰显示超急性期的脑梗死病灶。杨利霞等[6]研究则认为DWI技术在显示急性期脑梗死的灵敏度方面较神经功能缺失评分优越。本研究在大鼠脑梗死的超急性期用MRI成像方法成像脑梗死病灶,并利用ADC图计算缺血梗死体积，证实在脑梗死超急性期神经行为学评分不能可靠地反应脑梗死病变的严重程度。虽然MRI成像可用于评判MCAO模型,但由于其需时较多,而且会大大增加研究成本,实际研究中可行性较差。

TTC染色是脑梗死研究中常用的经典的病理染色方法[7]。本研究在大鼠MCAO术后24h行大鼠神经行为学评分及脑组织TTC染色证实,大鼠脑梗死后24h的神经行为学评分与其梗死严重程度相关性良好。因此,建议在大鼠脑梗死实验研究中,可选择术后24h神经行为学评分对MCAO模型进行评价。

神经行为学评分作为简便、经济的评价方法,在动物MCAO模型的研究中仍具有不可替代的作用,相信随着评分方法的逐步完善,可靠性将逐渐提高。

[1] Longa E,Weinstein P,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91.

[2] Garcia JH,Wagner S,Liu KF,etal.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation[J].Stroke,1995,26(4)： 627-634.

[3] Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,etal. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of neurologic examination[J].Stroke,2000,17(3)：472-476.

[4] Rogers DC,Campbell CA,Stretton JL,etal. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J].Stroke,2010,28(10)：2060-2065.

[5] Chauveau F,Cho TH,Riou A,etal. Does acute behavioral testing reflect successful ischemia in rats with transient middle cerebral artery occlusion[J].Int J Stroke,2012,7(6)：465-472.

[6] 杨利霞,贾文霄,丁 爽.DWI评价大鼠急性脑梗死模型制备的价值[J].中国医学影像技术,2009,25(4)：536-539.

[7] Ashioti M,Beech JS,Lowe AS,etal. Multi-modal characterization of the neocortical clip model of focal cerebral ischaemia by MRI, behavior and immunohistochemistry[J].Brain Res,2007,1145：177-189.

(收稿：2014-10-16)

The reliability of behavioral testing in experimental rats model of ischemia stroke

Department of Elderly Neurology,The Second Affiliated Hospital of Xi’an

Jiaotong University(Xi’an 710004) Wang Hui Wang Rong He Ya et al

Objective：To assess the reliability of behavioral testing in experimental rats model of ischemia stroke. Methods：Sprague-Dawley rats were subjected to 90 min of MCAO,then were evaluated with behavioral testing and scanned with MRI after they woke up. The behavioral testing were repeated 24 h after operation,followed by sacrifice. The cerebral infarction were detected by TTC examination. Results：In operated group,twenty rats have neural function deficient in varying degrees, and demonstrated massive or focal high signal on DWI,ten of them showed red cerebral infarction lesions on TTC staining. The scores of behavioral testing were correlated with infarction size on TTC staining on D1, conversely, No correlation was found between the scores on D0 and infarction size on ADC map. Conclusion：The behavioral testing fails to evaluate the neurologic deficient in super acute period of cerebral infarction of rats. There are significant correlation between behavioral score and cerebral infarction size at 24 h after operation.

Cerebral infarction Neurobehavioral manifestations Diffusion magnetic resonance imaging Rat

*陕西省科技攻关项目[2006K13-G1(7)]

大脑梗塞 神经行为学表现 弥散磁共振成像 大鼠

R743.32

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.003

▲通讯作者：西安交通大学第一附属医院影像科