人转铁蛋白受体基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

杨志军 郭永坤 张业森 戴宜武 姚学勤 徐如祥

干细胞是临床再生替代治疗极其重要的资源，干细胞移植治疗多种疾病的有效性和潜能日益受到重视，有着广阔的应用前景［1－5］。分子影像学，特别是MR 的发展使在活体状态下示踪移植干细胞成为现实。MR 具有极其精细的组织分辨率、空间分辨率、无游离辐射和非侵袭性等特点，通过MR 报告基因介导的分子成像可以监测移植细胞的分布，动态迁移的过程以及与宿主的整合情况。其中人转铁蛋白受体(human transferrin receptor，hTfR)报告基因在MR 分子成像中受到高度重视和广泛的关注［6］。本实验通过构建hTfR 慢病毒表达载体，为下一步以hTfR 为报告基因的活体干细胞MR 分子成像奠定基础，以期为今后临床活体示踪干细胞提供一种新的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株:pENTR221-hTfR 质粒购于广州复能基因有限公司;pLENTI6.3 载体由中国人民解放军军事医学科学院张莹莹博士惠赠;E.coli DH5a 感受态细菌购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要试剂:T4 连接酶、限制性内切酶和碱性磷酸酶购自NEB 公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA 公司;PCR 清洁试剂盒、DAN Maker 购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR 引物的设计和合成:根据Genbank 收录的hTfR 序列(BC001188)设计引物，在上游引物的5’端加入Bamh1 酶切位点和Kozak 序列，下游引物的5’端加入BamH1 酶切位点。上游引物序列:5’’-CGCG-［GCCACC］ ATGATGGATCAAGCTAGAGAT-CAGC-3’(下划线部分为BamH1 酶切位点，括号内部分为 Kozak 序列);下游引物序列:5’-CGCG-GATCCTTAAAACTCATTGCAATGTCCCAAC-3’(下划线部分为BamH1 酶切位点)。引物送北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 PCR 扩增hTfR 基因和胶回收:为保证基因克隆的正确率，采用具有高保真性和高扩增效率的Pfu DAN 聚合酶。以pENTR221-hTfR 基因质粒为模板，扩增hTfR。PCR 反应条件为:94℃预变性3 min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸4 min，共25 个循环，72℃延伸10 min。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，按照试剂盒说明书回收目的基因。

1.2.3 重组质粒pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 的构建:对空载体pLENTI6.3 和PCR 的回收目的产物分别用BamH1 进行酶切，反应条件为:37℃，4 h;在酶切反应2 h 时用NEB 的碱性磷酸酶进行去磷酸化反应，以减少载体自连产生假阳性克隆;对酶切载体进行1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收;酶切目的片段的纯化，根据PCR 清洁试剂盒说明书进行。将去磷酸化的酶切载体和目的片段按5∶1的摩尔比例，用T4 DNA 连接酶进行连接反应，4℃，连接过夜;次日连接产物转化E.coli DH5a 感受态细菌，涂布氨苄(Amp)抗性LB 平板，37℃摇菌过夜培养。

1.2.4 克隆鉴定:转化后，挑取单菌落，用上述设计合成好的PCR 的引物，进行PCR 扩增检测阳性菌落，反应条件为:94℃预变性3 min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸4 min，共25 个循环，72℃延伸10 min;PCR 产物行1%的琼脂糖凝胶电泳后鉴定。挑取阳性菌落接种于5 ml Amp 抗性的LB 培养基中，37℃220 r/min 摇菌过夜培养;按质粒提取试剂说明书提取质粒，并行BamH1 酶切，反应条件为:37℃，4 h，酶切产物1%的琼脂糖凝胶电泳后鉴定。酶切鉴定符合理论值的质粒菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

2 结果

2.1 hTfR 基因的扩增 以pENTR221-hTfR 为模板，经PCR 扩增后，1%的琼脂糖凝胶电泳可见1 条长约2 283 bp 的亮带，与理论值一致。见图1。

图1 hTfR PCR 产物电泳结果图

2.2 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重组慢病毒表达载体的构建和菌落PCR 鉴定 pLENTI6.3 带有EGFP 基因，将hTfR 基因连接入pLENTI6.3 载体即为pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP，连接产物转化E.coli DH5a 感受态细菌，涂布氨苄(Amp)抗性LB 平板，37℃摇菌过夜培养可见阳性菌落产生。挑10 个单克隆菌落，用上述hTfR 特异引物进行菌落PCR，行1%的琼脂糖凝胶电泳，结果显示:克隆8 有1 条长约2 283 bp 的亮带。见图2。

图2 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重组慢病毒表达载体菌落PCR 后电泳图

2.3 重组载体酶切鉴定和测序 提取菌落阳性克隆8 的质粒，行BamH1 酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳，结果显示:酶切图谱有11 条长约2 283 bp 的亮带;送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序结果显示:hTfR 基因序列正确，无突变或缺失。表明pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重组慢病毒表达载体构建成功。见图3。

图3 pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重组慢病毒表达载体BamH1 酶切后电泳图

3 讨论

hTfR 是一种广泛分布于细胞膜的跨膜糖蛋白，但其表达具有明显的组织分布差异性，在高增殖的基底上皮细胞和肠上皮细胞等有较高水平的表达，也在非增殖的细胞中表达，如:脑毛细血管内皮细胞、肝细胞、胰腺、睾丸细精管等。hTfR 位于人的第3 号染色体，编码区(CDS)长2 283 bp。hTfR 的表达主要受细胞内铁的水平进行转录后水平的调节，hTfR mRNA3＇端非编码区存在着5 个连锁作用的铁效应元件(five iron response elements，IRE)是hTfR 表达调控的关键结构，这些铁的效应元件被2 种RNA 结合的铁调节蛋白(iron regulatory proteins，IRP)识别，并控制着mRNA 的稳定性［7］。当细胞内铁不足时，IRP-1 结合IRES 增加了TfR mRNA 的稳定性，因此TfR 的mRNA 被翻译，增加了细胞表面的TfR。

目前干细胞活体非侵袭性示踪的分子影像学技术主要有光学成像、核素成像和磁共振成像(MRI)等。相比其他技术，MRI 有着极其精细的空间分辨率和组织分辨率，对深层组织成像无困难，且无电离辐射，已广泛的用于临床;对于移植的干细胞，MRI 还可以获得移植周围组织的解剖和生理信息，包括移植灶周围的水肿和炎症，这些为临床医生提供了更多的信息，有助于了解细胞移植治疗的各个方面［8］。以报告基因为基础的MRI 具有MR 信号不会或很少受干细胞分裂的影响，且报告基因的表达产物可以反应干细胞的功能和活力等优点［9，10］。目前用于MRI 的报告基因有:β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、转铁蛋白受体、铁蛋白、富含赖氨酸蛋白等，其中转铁蛋白受体的报告基因应用最为广泛［10］。hTfR 是细胞膜上的受体蛋白，与特异性配体转铁蛋白(Tf)结合介导Fe 的细胞内转运。在MR 的分子影像中，将hTfR 基因导入干细胞，干细胞过表达hTfR，与Tf 连接的磁性氧化铁即Tf 的分子探针，通过转铁蛋白受体介导的内吞作用转运到细胞内。这样干细胞内磁性氧化铁纳米颗粒的蓄积，实现了MRI信号的逐步放大，提高了对干细胞信号的敏感性，从而获得MR T2WI 上特征性的低信号［11］。Wang 等［12］应用转铁蛋白受体(TfR)作为报告基因，转铁蛋白偶联的超小顺磁性氧化铁纳米颗粒的复合物(Tf-USPIO)作为MR 的报告探针，对小鼠MDA-MB-231 细胞的乳腺癌的动物模型静脉注射Tf-USPIO 分子探针，发现肿瘤MR T2 的弛豫时间比对照组显著缩短，这表明转铁蛋白受体为报告基因成功的进行了MR 活体分子成像，可以对内皮抑制素基因的表达和治疗进行了活体动态监测。目前的研究表明，TfR 报告基因介导的Tf-USPIO 分子探针的细胞转运和蓄积，能够对TfR 进行MR 基因显像和示踪，并可以检测TfR 的表达水平［13－15］。

与其他病毒载体系统相比，慢病毒可以稳定高效的感染分裂和非分裂细胞，无明显免疫反应，同时能够转染广泛的组织等优点，近年来被广泛用于基因的转导载体［16－18］。因此通过慢病毒介导的基因转导，使报告基因在靶细胞稳定的表达，从而达到长期检测的目的。在本实验中，只扩增了hTfR 编码区2 283 bp，去除了细胞内Fe 对的调控。采用高保真的Pfu DNA 聚合酶扩增目的片段，减少了碱基的错配或突变。对于重组质粒的鉴定，首先进行了简单快速的菌落PCR 初步筛选鉴定，用初步筛选的阳性克隆，摇菌、小提质粒、酶切鉴定和基因测序，结果证实pLENTI6.3-hTfRIRES-EGFP 重组慢病毒表达载体的构建成功。

干细胞低水平表达hTfR，且受细胞内IRE 的负反馈调节［8］，无法实现以hTfR 为标记物的MR 分子影像成像。因此如果利用转基因的方法，将hTfR 基因导入干细胞内，使其过表达hTfR，因而干细胞可摄取较多的磁性氧化铁纳米颗粒，使其在MR T2WI 信号特异性减低，从而达到对移植后干细胞长期无侵袭性的活体示踪。我们构建的pLENTI6.3-hTfR-IRES-EGFP 重组慢病毒载体，还带有EGFP 报告基因，通过组织冰冻切片的荧光显微镜检测，进行离体状态下的EGFP 报告基因荧光成像，从而达到活体和离体检测的相互印证。本实验为下一步包装慢病毒、感染干细胞，进行干细胞体外、体内的MRI 活体示踪提供了实验基础。

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