连花清瘟颗粒微生物限度检查方法的研究

北京以岭药业有限公司（102600）李志红 王磊 李海南 王彦彦

1 材料与仪器

样品为连花清瘟颗粒三批，批号分别为091201、091202、091203，由北京以岭药业有限公司生产。

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基均由北京三药科技开发公司生产，按说明书要求配制，121℃湿热灭菌15 min，备用。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]，大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]，乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]，黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]。

脉动真空灭菌器（XG1.G型，山东新华医疗器械股份有限公司），生物安全柜（BHC-1300ⅡA2型，苏州净化设备有限公司），生化培养箱（LRH-250F,上海一恒科技有限公司），霉菌培养箱（MJ-250Ⅱ型，上海一恒科技有限公司），电热恒温水箱（HHW21.420型，天津泰斯特仪器有限公司）。

2 预试验[1]

按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法中的平皿法进行回收率试验，结果金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均小于70%，其余试验菌株的回收率均大于70%，采用培养基稀释法进行试验（1∶10供试液，0.2ml/皿），金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均大于70%。

采用常规法对样品进行大肠埃希菌检查，结果阳性菌生长良好，说明本品在该条件下对大肠埃希菌的抑制作用可以忽略。

据此，拟定本品的微生物限度检查方法草案如下。

取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶10的供试液；细菌数采用培养基稀释法，取1∶10的供试液1ml，等量分注于5个平皿中，每皿0.2ml；霉菌及酵母菌数采用平皿法，取1∶10的供试液1ml，注入平皿中，每皿1ml；大肠埃希菌采用常规法。

3 方法学验证[1][4]

3.1 菌液的制备按照中国药典2010年版一部附录微生物限度检查法进行。

3.2 供试液的制备

取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶10的供试液。

3.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

3.3.1 试验组

取1∶10供试液0.2ml和枯草芽孢杆菌菌液1ml，分别注入同一平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基，混匀，待凝固后置30℃～35℃生化培养箱培养3天，计数。用同样的方法对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌进行试验。

取1∶10供试液1ml和白色念珠菌菌液1ml，分别注入同一平皿中，立刻倾注玫瑰红钠培养基，混匀，待凝固后置23℃～28℃霉菌培养箱培养5天，计数。

取1∶10供试液1ml和黑曲霉孢子悬液1ml，分别注入同一平皿中，立刻倾注玫瑰红钠培养基，混匀，待凝固后置23℃～28℃霉菌培养箱培养5天，计数。

结果见附表1。

3.3.2 菌液组

分别取上述菌液1ml，采用平皿法，测定制备好的菌液的菌数（cfu/ml），所用培养基和培养条件同3.3.1，结果见附表2。

3.3.3 供试品对照组

取1∶10的供试液1ml，等量分注于5个平皿中，每皿0.2ml，立刻倾注营养琼脂培养基，混匀，待凝固后置30℃～35℃生化培养箱培养3天，测定其本底的细菌数。

取1∶10的供试液1ml，注入平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，待凝固后置23℃～28℃霉菌培养箱培养5天，测定其本底的霉菌及酵母菌数。结果见附表3。

3.3.4 回收率

附表1 试验组菌落计数（cfu/皿）

附表2 菌液组菌落计数（cfu/皿）

附表3 供试品对照组菌落计数（cfu/皿）

附表4 回收率（%）

附表5 大肠埃希菌检查结果

分别进行3次独立试验，结果见附表4。

结果显示，各试验菌的回收率均大于70%，表明该方法可以有效地减弱本品对试验菌的抑制作用。

3.4 大肠埃希菌检查方法的验证

3.4.1 供试品组

取1∶10供试液10ml，加至100ml乳糖胆盐培养基中，置30℃～35℃培养箱培养24h。

3.4.2 空白对照组

取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，加至100ml乳糖胆盐培养基中，置30℃～35℃培养箱培养24h。

3.4.3 试验组

取1∶10供试液10ml，加至100ml乳糖胆盐培养基中，再加入1ml大肠埃希菌菌液，置30℃～35℃培养箱培养24h。

分别取上述培养物0.2ml，加至含5ml4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基试管中，置30℃～35℃培养箱培养5～24h，观察结果。见附表5。

结果显示，试验组检出大肠埃希菌，供试品组和空白对照组结果为阴性，说明该方法检查大肠埃希菌可行。

综上所述，草案拟定的方法可行。

4 确定的微生物限度检查方法[6][7]

取本品10 g，加p H 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶10的供试液；细菌计数采用培养基稀释法，取1∶10的供试液1ml，等量分注于5个平皿中，每皿0.2ml；霉菌及酵母菌数采用平皿法，取1∶10的供试液1ml，注入平皿中，每皿1ml；大肠埃希菌采用常规法。

5 讨论

由于中成药的成分复杂，常有抑菌性，如果不对微生物限度检查方法进行验证，只采用平皿法，会使结果产生较大的误差。因此要采取适当的方法减弱供试液的抑菌性，同时对方法进行验证，才能确保结果的可靠性。如何减弱抑菌性，在方法的选择上可以优先考虑稀释法，简单可靠。离心沉淀法较为繁琐且有局限性，故未采用。

本品供试液不能全部透过滤膜，薄膜上表面有较多残留，不适合薄膜过滤法。本品抑菌成分复杂，也很难采用中和法。因此优先选择培养基稀释法，验证的结果表明，此方法可有效消除连花清瘟颗粒的抑菌性，使微生物限度检查结果准确可靠[2][3][5]。