无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

胡丹丹，王付才，张震宇，孙付保，周邦炜（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室和糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

胡丹丹，王付才，张震宇*，孙付保，周邦炜
（江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室和糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

为实现无外源脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸，本实验采用定点突变和基因共表达的方法构建重组大肠杆菌：首先对L-脯氨酸生物合成途径中的关键酶谷氨酸激酶进行定点突变E143A、K145A，以增强L-脯氨酸生物合成能力；然后引入脯氨酸4-羟化酶基因，通过两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化，而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增强的菌株在摇瓶阶段L-脯氨酸的产量可达到1.4 g/L；proBA2与hyp双基因共表达菌株的反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L，比原始菌株提高了一倍，经发酵优化后得到培养基为：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨15 g/L，硫酸亚铁3 mmol/L，硫酸镁1 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，氯化钙0.015 g/L，在这个培养条件下反式-4-羟脯氨酸的产量为220.0 mg/L，比优化前提高1.2倍。

脯氨酸4-羟化酶，反式-4-羟脯氨酸，L-脯氨酸，谷氨酸激酶，共表达

反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline，Hyp，反式-4-羟脯氨酸）是一个重要的手性合成元件，是合成某些化学药物的重要前体物［1-2］，还是合成其他羟脯氨酸同分异构体的重要起始原料［2-3］。传统生产反式-4-羟脯氨酸的方法主要是水解动物胶原蛋白，随着基因工程等技术的发展，其生产方法也有了很大的进步。1995年，Serizawa等［4］开创了利用微生物发酵法生产反式-4-羟脯氨酸的先河；2000年，Shibasaki等［2］构建的生产反式-4-羟脯氨酸的重组E.coli W1485发酵罐培养100 h的产量达到41 g/L；2014年，刘合栋等［5］构建的生产反式-4-羟脯氨酸的重组E.coli BL21（DE3）发酵罐水平的产量达到42.5 g/L。这些研究中均需要添加外源脯氨酸来生产反式-4-羟脯氨酸，生产成本较高。

微生物体内合成L-脯氨酸是以谷氨酸为底物，经谷氨酸激酶、谷氨酸脱氢酶、Δ′-二氢吡咯-5-羧酸还原酶的依次催化完成［6-7］，其中谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制［7］，是限速酶［8］，这也是反式-4-羟脯氨酸生产过程中需要添加外源脯氨酸的原因之一。对于谷氨酸激酶的研究，大都通过基因定点突变来改变其序列中的一个或多个氨基酸［9］，有些突变降低了L-脯氨酸对谷氨酸激酶的反馈抑制作用，使微生物细胞可以大量积累L-脯氨酸。通过对大肠杆菌谷氨酸激酶的两个氨基酸位点E143A、K145A进行突变得到突变基因proBA2，降低L-脯氨酸对谷氨酸激酶的反馈抑制作用；然后引入脯氨酸4-羟化酶基因hyp，使proBA2和hyp共表达，实现在无外源L-脯氨酸的条件下，直接从葡萄糖发酵生产反式-4-羟脯氨酸，以期提高反式-4-羟脯氨酸的产量并降低生产成本，应用前景广阔。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验所用菌株和质粒见表1；实验用到的引物见表2；LB培养基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，调pH至7.0～7.2，固体培养基另加1.5%的琼脂粉；L-脯氨酸发酵培养基（PF培养基） 葡萄糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，FeSO41 mmol/L，（NH4）2SO410 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L，调pH至8.0；反式-4-羟脯氨酸发酵培养基（TF培养基）葡萄糖10 g/L，蛋白胨8 g/L，FeSO41 mmol/L，（NH4）2SO410 g/L，K2HPO41 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L，调pH至8.0。

TC-512型PCR扩增仪TECHNE；SW-CJ-ID型单人净化工作台苏州净化设备有限公司；HH-W600型数显三用恒温水箱江苏金坛荣华仪器制造有限公司；IEC型高速冷冻离心机THERMO；HYG-A型全温摇瓶柜江苏太仓实验设备厂；DYY-10C型电泳仪北京市六一仪器厂；UV-1100型紫外分光光度计上海精密仪器仪表公司；精密pH计梅特勒-托利多仪器上海有限公司；凝胶成像仪BIORAD。

表1　实验所用菌株和质粒Table 1　The strains and plasmids used in this work

表2　实验所用引物Table 2　Primers used in this work

1.2实验方法

1.2.1L-脯氨酸及反式-4-羟脯氨酸浓度测定L-脯氨酸的测定采用酸性茚三酮显色法［10］：将发酵液离心后，取上清，适当稀释后取1 mL于10 mL试管中，加入1 mL冰乙酸；摇匀后加入1 mL酸性茚三酮；摇匀后沸水浴1 h；接着加入冰乙酸2 mL，摇匀后冷水冷却，然后测定515 nm波长处的吸光度值，得到的数据代入标准曲线即可测得重组大肠杆菌的L-脯氨酸积累量。10 g/L L-脯氨酸标准液经不同浓度稀释后，分别得到L-脯氨酸浓度为0、5、8、11、14、17、20 mg/L的L-脯氨酸标准液溶液，在不同浓度的L-脯氨酸标准溶液中依次加入冰乙酸和酸性茚三酮反应，方法同以上所述，于515 nm波长处测定吸光度值。以OD515的值为横坐标，L-脯氨酸浓度为纵坐标，绘制出L-脯氨酸标准曲线，得到一个线性回归方程：Y=aX+b，式中Y为L-脯氨酸浓度（mg/L），X为OD515的值，由此公式得到的L-脯氨酸浓度再乘以样品的稀释倍数即为样品中的L-脯氨酸浓度。

反式-4-羟脯氨酸的测定采用氯胺T法［11］：将发酵液离心后，取上清，稀释后取2.5 mL于10 mL试管中，加入1 mL氯胺T，摇匀后在室温中放置20 min；然后加入1 mL显色剂，摇匀后迅速将试管置于60℃水浴锅中，20 min后取出冷水冷却，用分光光度计在560 nm波长处测定吸光度值，得到的数据代入标准曲线即可测得重组大肠杆菌的反式-4-羟脯氨酸积累量。1 g/L反式-4-羟脯氨酸标准液经不同浓度稀释后，分别得到反式-4-羟脯氨酸浓度为0、1、2、3、4、5 mg/L的反式-4-羟脯氨酸标准溶液，将稀释后不同浓度的反式-4-羟脯氨酸溶液按照上述方法，测定560 nm波长处的吸光度值，以OD560为横坐标，反式-4-羟脯氨酸的浓度为纵坐标，绘制出反式-4-羟脯氨酸标准曲线，得到一个线性回归方程：Y=aX+b，式中Y为反式-4-羟脯氨酸浓度（mg/L），X为OD560的值，由此公式得到的反式-4-羟脯氨酸浓度再乘以样品的稀释倍数即为样品中的反式-4-羟脯氨酸浓度。

1.2.2载体构建以E.coli BL21（DE3）基因组DNA为模板，P1、P2为上下游引物，PCR扩增得到野生型proBA基因。色氨酸串联启动子基因序列用EcoRⅠ（G^AATTC）、HindⅢ（A^AGCTT）双酶切pUC19-Ptrp2-hyp获得。将proBA和色氨酸串联启动子重组到载体上，得到pET28a-Ptrp2-proBA。以pET28a-Ptrp2-proBA为模板，P3、P4为上下游引物，全质粒PCR扩增获得含有点突变的质粒pET28a-Ptrp2-proBA2。用EcoRⅠ（G^AATTC）、BamHⅠ（G^GATCC）双酶切pUC19-Ptrp2-hyp得到Ptrp2-hyp片段，同时用同样的内切酶处理pET28a-Ptrp2-proBA2，胶回收得到目的基因片段和载体，连接得到重组质粒pET28a-PH。以pET28a-PH为模板，P5、P6为上下游引物，PCR扩增得到PH片段（hyp-Ptrp2-Ptrp2-proBA2），用内切酶BamHⅠ（G^GATCC）、SacⅠ（G^AGCTC）同时双酶切处理PCR克隆得到的基因片段和质粒pUC19，胶回收后连接得到重组质粒pUC19-PH。

1.2.3重组菌的发酵验证将构建好的重组质粒导入宿主细胞中得到重组菌，进行发酵验证。含有重组质粒pET28a-Ptrp2-proBA2的重组菌用PF培养基发酵验证，培养条件：30℃，220 r/min培养24 h。含有重组质粒pUC19-PH、pET28a-PH的重组菌用TF培养基发酵验证，培养条件：pH8.0，30℃，220 r/min培养24 h。

1.3发酵培养基优化

在前期单因素实验的基础之上，选择葡萄糖、胰蛋白胨、硫酸亚铁、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钠的浓度进行七因素三水平正交实验，各因素的水平见表3。

表3　正交实验因素水平表Table 3　Factors and levels table of orthogonal experiment

1.4数据处理

利用软件IBM SPASS Statistics 20进行分析。

2　结果与分析

2.1L-脯氨酸生产菌株的构建及发酵验证

2.1.1重组质粒pET28a-Ptrp2-proBA2的构建重组质粒pET28a-Ptrp2-proBA2酶切验证电泳结果见图1，泳道1所示的条带大小约为8100 bp，是该重组质粒的大小；泳道2所示的两条带分别是质粒pET28a（5369 bp）、目的片段Ptrp2-proBA2（约2700 bp）的条带，电泳验证的这些条带大小与预期相符，重组质粒构建成功。

图1　质粒pET28a-Ptrp2-proBA2酶切电泳验证Fig.1　The electrophoresis verification of the plasmid pET28a-Ptrp2-proBA2 by enzyme digestion

图2　重组质粒pET28a-Ptrp2-proBA2结构Fig.2　The structure of recombinant plasmid pET28a-Ptrp2-proBA2

重组质粒pET28a-Ptrp2-proBA2结构如图2所示，其含有突变基因proBA2。在大肠杆菌的基因图谱上，proB和proA紧邻［8-9］，两者串联表达并相互影响，构成一个proBA操纵子［12-13］。含有两个氨基酸突变位点的proBA2基因，表达的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低，从而使脯氨酸生物合成途径受脯氨酸的反馈抑制作用显著降低，可以实现L-脯氨酸的大量合成积累。该重组质粒还含有色氨酸串联启动子［14］，在宿主细胞中无需添加诱导剂即可高效表达proBA2。

2.1.2L-脯氨酸发酵验证含有突变基因proBA2的E.coli菌株L-脯氨酸的产量明显高于不含质粒的原菌株，其中E.coli JM109/pET28a-Ptrp2-proBA2菌株的L-脯氨酸产量是E.coli JM109原菌的27倍，是E.coli BL21（DE3）/pET28a-Ptrp2-proBA2的21倍，含有该突变基因的重组质粒pET28a-Ptrp2-proBA2更适合在E.coli JM109菌株中表达（表4）。在30 mL的PF培养基中发酵培养24 h后L-脯氨酸的产量可以达到1436.2 mg/L。

表4　原菌及重组菌中L-脯氨酸的产量Table 4　The productivity of L-proline in E.coli

proB编码的谷氨酸激酶是L-脯氨酸生物合成系统中的关键酶，该酶的活性受脯氨酸的反馈抑制作用。本研究通过基因工程手段对谷氨酸激酶基因进行定点突变后，proBA2编码的谷氨酸激酶受脯氨酸的反馈抑制作用显著降低，将突变基因转入E.coli JM109中进行表达，L-脯氨酸的摇瓶产量可以达到1.4 g/L。Takeshi Shibasaki等［1］对proB进行定点突变得到proB74并将该突变基因导入E.coli W1485 putA菌株中进行表达，L-脯氨酸的产量达到1.2 g/L。K E Rushlow等［9］对E.coli的proB进行突变得到的突变基因DHPR proB编码的谷氨酸激酶第143位的谷氨酸突变为丙氨酸后，其受脯氨酸的反馈抑制作用比野生型的酶低100倍。Kenji Omori等［15］对来自脯氨酸高产菌株Serratia marcescens的proBA operon进行研究后发现，谷氨酸激酶第117位的丙氨酸突变为缬氨酸后的谷氨酸激酶受脯氨酸的反馈抑制作用比野生型的酶低700倍。近来，也有许多针对谷氨酸激酶的结构研究。Isabel Perez-Arellano等［8，16］研究了谷氨酸激酶的PUA结构域及脯氨酸与该酶的结合位点，主要利用定点突变技术进行研究；Clara Marco-Marin等［17］则对谷氨酸激酶的结构进行了较全面地研究分析，包括AAK结构域及PUA结构域；Isabel Perez-Arellano等［18］在研究谷氨酸激酶结构的同时利用基因工程技术对酶进行定点突变，更加深入透彻的展示了酶的结构、活性与氨基酸之间的关系。诸多对谷氨酸激酶的研究极大地促进了L-脯氨酸的工业生产，对得到的重组菌株E.coli JM109/pET28a-Ptrp2-proBA2进行了培养，L-脯氨酸的摇瓶产量可以达到1.4 g/L，相信对培养条件进行优化后L-脯氨酸的产量会具有很大的提升空间。

2.2重组大肠杆菌发酵生产反式-4-羟脯氨酸

2.2.1反式-4-羟脯氨酸重组菌的构建质粒酶切验证结果如图3所示，其中（A）是重组质粒pUC19-PH酶切验证结果，泳道1中的两条带分别是基因片段hyp-Ptrp2-Ptrp2-proBA2（PH片段，约3100 bp）、pUC19质粒（2686 bp），泳道2中的条带是该重组质粒的大小（约6400 bp），这些片段的大小均符合预期目标；（B）是重组质粒pET28a-PH酶切验证结果，泳道1的条带是该重组质粒的大小（约9100 bp），泳道2中的条带是质粒pET28a-Ptrp2-proBA2（8058 bp）、Ptrp2-hyp（1058 bp），这些条带的大小也都与预期目标相符。该电泳图说明了重组质粒pUC19-PH、pET28a-PH构建成功。

图3　质粒酶切电泳验证Fig.3　The electrophoresis verification of the recombinant plasmid by enzyme digestion

重组质粒pUC19-PH、pET28a-PH都含有基因proBA2和hyp，两基因在各自的色氨酸串联启动子的作用下分别表达，先将葡萄糖转化为L-脯氨酸，再转化为反式-4-羟脯氨酸，以实现在无外源L-脯氨酸的条件下，直接从葡萄糖发酵生产反式-4-羟脯氨酸。

2.2.2反式-4-羟脯氨酸发酵验证反式-4-羟脯氨酸的产量如表5所示。在使用TF培养基发酵培养24 h后，各菌株的反式-4-羟脯氨酸产量出现较大差异：含有重组质粒pUC19-PH的E.coli BL21（DE3）反式-4-羟脯氨酸的产量最高，与双质粒表达菌株的产量较接近；同时双质粒表达菌株的L-脯氨酸均有一定量的积累，但以E.coli JM109作为宿主时的L-脯氨酸积累量最高，这与表4的结果吻合；与含有pUC19-Ptrp2-hyp的重组菌的反式-4-羟脯氨酸产量相比，含有重组质粒pUC19-PH和双质粒表达体系的E.coliBL21（DE3）菌株的产量都提高了约1倍；表5的结果也说明hyp基因在质粒pUC19上的表达明显高于在质粒pET28a上的表达。

表5　原菌及重组菌中反式-4-羟脯氨酸的积累量Table 5　The productivity of trans-4-hydroxyproline in E.coli

不同发酵时间下各菌株的反式-4-羟脯氨酸产量如图4所示，在发酵14 h时重组菌E.coli BL21（DE3）/ pUC19-PH的反式-4-羟脯氨酸的产量略低于双质粒表达系统，但是发酵14 h以后该重组菌的反式-4-羟脯氨酸的产量明显高于双质粒表达菌株。

图4　不同发酵时间下下各菌株的Hyp产量Fig.4　Hyp yield of virious strains under the different fermentation time

2.3培养基优化的正交实验结果

正交实验结果如表6所示，在反式-4-羟脯氨酸发酵培养基中，各个因素对产物积累量影响的主次顺序是：胰蛋白胨浓度＞硫酸铵浓度＞硫酸亚铁浓度＞葡萄糖浓度＞磷酸氢二钾浓度＞硫酸镁浓度＞氯化钠浓度；该正交实验得到的各因素的最优水平组合为A1B3C3D1E2F3G1，由于正交实验中氯化钙的浓度固定不变为0.015 g/L，所以得到的反式-4-羟脯氨酸的发酵培养基的各因素及水平的最佳浓度为：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨15 g/L，硫酸亚铁3 mmol/L，硫酸镁1 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，氯化钙0.015 g/L。

验证正交优化结果：按照优化后得到的培养基成分培养重组大肠杆菌BL21（DE3）/pUC19-PH，培养24 h后反式-4-羟脯氨酸产量为220.0 mg/L，用优化前的TF培养基培养24 h，反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L，优化后提高约1.2倍。

3　讨论

本实验中用到的脯氨酸4-羟化酶基因（hyp）来源于指孢囊菌RH1［5］，该酶可以把游离的脯氨酸转化为反式-4-羟脯氨酸，在已构建的脯氨酸合成途径增强了的重组大肠杆菌细胞内再引入hyp，使生成的脯氨酸在hyp表达的脯氨酸-4-羟化酶的作用下继续转化生成反式-4-羟脯氨酸，实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化。关于两基因的共表达策略，耿风廷等［19］指出大肠杆菌表达系统主要有多顺反子表达系统与双质粒表达系统，其中双质粒表达系统的优势高于前者，但需要少量抗生素来维持质粒的共存，共存时间较短；马蓉等［20］指出单一载体上由独立启动子分别驱动两个基因表达的产量高于单个启动子驱动的两个基因的表达，同时用少量抗生素维持不相容质粒来表达多个基因也是一个较好的方法。本工作中构建的产反式-4-羟脯氨酸的的重组菌中既有单一载体/独立启动子驱动的的载体、也有不同抗性的双质粒共表达载体，实验结果（图4）表明，发酵14 h以后含有双质粒表达系统的重组菌的反式-4-羟脯氨酸的产量低于单一载体/独立启动子驱动的重组菌的产量，表明双质粒表达系统稳定共存、高效表达的时间是有限的，发酵约14 h后稳定共存环境被打破。

反式-4-羟脯氨酸的生产菌株E.coli BL21（DE3）的目标氨基酸的产量相比于Shibasaki等［1］的研究低，一方面是因为E.coli W1485 putA菌株中脯氨酸脱氢酶基因（putA）经过突变失活，不能表达脯氨酸脱氢酶，细胞中的脯氨酸只能在脯氨酸4-羟化酶的作用下转化为反式-4-羟脯氨酸；另一方面是E.coli W1485是脯氨酸4-羟化酶的最佳宿主［21］，在这个宿主中该酶的表达效果明显高于在E.coli BL21（DE3）中的表达。本工作中对反式-4-羟脯氨酸生产菌株进行发酵条件优化后，氨基酸的产量提高了1.2倍，这一结果表明了无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸方法的应用价值。后续的工作中可以对putA进行基因敲除、继续优化宿主菌，以期最大限度的提高反式-4-羟脯氨酸的产量，实现无外源脯氨酸发酵生产该氨基酸的工业生产。

4　结论

产L-脯氨酸能力增强的重组大肠杆菌E.coli JM109/pET28a-Ptrp2-proBA2在摇瓶阶段，以葡萄糖为单一碳源的培养基中培养24 h后，L-脯氨酸产量为1.4 g/L。不需添加外源L-脯氨酸产反式-4-羟脯氨酸的重组大肠杆菌E.coli BL21（DE3）/pUC19-PH在摇瓶阶段，以葡萄糖为单一碳源的培养基中培养24 h后，反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L；对发酵条件进行优化以后，得到培养基为：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨15 g/L，硫酸亚铁3 mmol/L，硫酸镁1 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，氯化钙0.015 g/L。利用优化后的培养进行发酵生产反式-4-羟脯氨酸，产量达到220.0 mg/L，相比优化前提高了1.2倍。

对上述两个菌株进行发酵条件优化后，相应氨基酸的产量都得到了大幅提升。proBA2与hyp共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化，而不需要添加外源L-脯氨酸，这对于反式-4-羟脯氨酸的发酵生产具有很好的应用价值。

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Construction and fermentation optimization of a recombinant Escherichia coli for the production of trans-4-hydroxyproline without extra addition of proline

HU Dan-dan，WANG Fu-cai，ZHANG Zhen-yu*，SUN Fu-bao，ZHOU Bang-wei
（School of Biotechnology，Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry& Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to produce trans-4-hydroxyproline directly from the conversion of glucose without extra addition of L-proline，site-directed mutagenesis and gene co-expression were used in this experiment to construct the recombinant E.coli.Firstly，two mutations E143A，K145A were made on glutamate kinase，which was the key enzyme of L-proline biosynthetic pathway，to enhance the L-proline biosynthesis.Then，proline-4-hydroxylase gene was inserted to co-expressed with the mutated glutamate kinase gene.Co-expression of the two genes resulted in a continuous conversion from glucose to trans-4-hydroxyproline，without the extra addition of exogenous L-proline.At the shaking-flask stage，output of L-proline by the biosynthetic capacity enhanced strain reached 1.4 g/L.Yield of trans-4-hydroxyproline by the co-expression strain of proBA2 and hyp was 96.9 mg/L，which doubled than the original strain.After the fermentation optimization，the optimum medium was：glucose 10 g/L，tryptone 15 g/L，ferrous sulfate 3 mmol/L，magnesium sulfate 1 g/L，dipotassium phosphate 3 g/L，calcium chloride 0.015 g/L.The recombinant E.coli was cultured with the optimized medium for 24 h. The output of trans-4-hydroxyproline was achieved at 220.0 mg/L，a 1.3-fold increase than the original strain. Key words：proline 4-hydroxylase；trans-4-hydroxyproline；L-proline；glutamate kinase；co-expression

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0168-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.027

2015－03－09

胡丹丹（1987-），女，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail：hudandan604@163.com。

张震宇（1976-），男，教授，研究方向：发酵工程、生物化学与分子生物学，E-mail：zhangzy@jiangnan.edu.cn。

高等学校博士学科点专项科研基金（200802951036）；国家自然科学基金（30800018，30970058）；江苏省自然科学基金（BK2012554）。