盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤的影响

杜学柯，潘灵辉，裴圣林，葛万运

盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤的影响

杜学柯，潘灵辉，裴圣林，葛万运

目的探讨盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法用过氧化氢（H2O2）加入A549细胞培养液中制成A549细胞氧化损伤模型，实验分为空白对照组（C组）、H2O2处理组（H组）和盐酸戊乙奎醚-过氧化氢处理组（P组）。用MTT方法测A549细胞存活率，用TUNEL方法测定细胞凋亡指数，并测定细胞内的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）含量。结果与C组比较，H组的细胞存活率下降，凋亡指数增加，MDA含量上升，SOD、GSH、NADPH的含量下降（P＜0.05）。与H组比较，P组的细胞存活率增加，凋亡指数下降，MDA含量下降，SOD、GSH、NADPH的含量增加（P＜0.05）。结论盐酸戊乙奎醚对A549细胞过氧化损伤具有保护作用。

盐酸戊乙奎醚；肺泡Ⅱ型上皮细胞；A549细胞；氧化损伤

肺泡上皮屏障功能损伤是肺损伤发生的关键，而肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡上皮屏障的重要组成部分，其损伤及修复过程，是急性肺损伤发病过程中的重要环节。盐酸戊乙奎醚具有抗炎、抗凋亡的作用，对脓毒血症造成的脏器损伤具有保护作用［1］。研究表明盐酸戊乙奎醚能改善已有肺疾病患者的呼吸力学指标［2］，对肺功能具有保护作用，其机制可能是下调肺内Toll样受体4（TLR4）的表达，抑制与TLR4信号传导通路有关的下游炎症细胞因子。但盐酸戊乙奎醚在体外对肺泡Ⅱ型上皮细胞是否具有保护作用尚少见报道。本研究在过氧化氢（H2O2）攻击损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞基础上，观察盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型上皮细胞的氧化损伤是否具有保护作用，探讨抗胆碱药物防治急性呼吸窘迫综合征（ARDS）潜在的可能性。

1 材料与方法

1.1实验材料肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞株，由广西医科大学实验中心提供；高糖DMEM培养液、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；小牛血清和胰蛋白酶购自武汉飞羿科技有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自华美生物公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物制品所；实验仪器由广西医科大学实验中心提供。

1.2细胞培养、氧化应激处理和分组人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞在含10%小牛血清的高糖DMEM培养基中传代培养，培养细胞置于37℃、5%CO2培养箱中，隔天更换培养基，选取对数生长期细胞进行实验处理。氧化应激处理方法：将细胞分为空白对照组（C组）；H2O2处理组（H组），用500 μmol/L H2O2处理A549细胞；盐酸戊乙奎醚-过氧化氢处理组（P组），预先20 min给予2 mg/L盐酸戊乙奎醚［3］，然后加入500 μmol/L H2O2处理A549细胞4 h。

1.3MTT法检测细胞存活率用0.25%胰蛋白酶消化，以1.5×104/L密度的细胞接种到96孔板，每孔100 μL，每孔设3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱24 h后，弃培养液。以不含细胞的培养液作空白对照，按上述方法处理各组后，加入无血清培养基100 μL和MTT溶液20 μL（5 g/L）37℃培养4 h显色。加入DMSO 150 μL，振荡至结晶物充分溶解后，空白对照调零，用酶联免疫仪测各孔波长在490 nm处的光密度值（OD490）。细胞存活率计算公式：细胞存活率=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.4细胞凋亡指数的测定采用TUNEL方法测定，在光镜下细胞核呈棕褐色视为阳性凋亡细胞，此外部分细胞浆也可因核内DNA碎片的逸出呈棕褐色。高倍镜（400倍）下，任选3个视野，每个视野中计100个细胞中的阳性细胞数为凋亡指数。

1.5各组细胞内NADPH、还原型谷胱甘肽（GSH）、SOD、MDA水平的监测以1×105/L密度的细胞接种到24孔板上，每孔0.5 mL，置于37℃、5%CO2培养箱24 h后。按上述方法处理各组，每组设3个复孔。处理后，弃培养液，用PBS液冲洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化，等量PBS液收集细胞。超声细胞破碎仪破碎后，按照相关试剂盒说明进行测定。

1.6统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MTT结果和凋亡指数与C组比较，H组和P组细胞存活率下降，凋亡指数增加，与H组比较，P组的细胞存活率增加，凋亡指数下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

Tab.1Comparison of viability and apoptotic rate of A549 cells between three groups表1 3组细胞的存活率和凋亡指数（n=3，%，）

Tab.1Comparison of viability and apoptotic rate of A549 cells between three groups表1 3组细胞的存活率和凋亡指数（n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与H组比较，P＜0.05；表2同

细胞存活率93.3±0.4 66.5±3.9a86.6±1.8ab69.420＊＊组别C组H组P组F凋亡指数6.6±0.6 32.9±3.9a21.4±2.3ab74.534＊＊

2.2盐酸戊乙奎醚对H2O2损伤的549细胞抗氧化指标的影响与C组比较，H组MDA水平明显增高，SOD、GSH和NADPH含量下降；与H组比较，P组MDA水平明显降低，SOD、GSH和NADPH含量增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Tab.2Comparison of MDA，SOD，GSH and NADPH contents between three groups表2 3组细胞内MDA、SOD、GSH和NADPH含量的比较（n=3，）

Tab.2Comparison of MDA，SOD，GSH and NADPH contents between three groups表2 3组细胞内MDA、SOD、GSH和NADPH含量的比较（n=3，）

SOD（U/mg）19.663±0.614 15.559±0.612a 17.372±0.451ab 39.849＊＊组别C组H组P组F MDA（nmol/L）8.167±0.315 11.963±0.745a 9.422±0.407ab 41.054＊＊GSH（U/mL）34.230±0.543 27.401±0.713a 30.633±0.556ab 94.348＊＊NADPH（μmol/L）10.701±0.797 6.387±0.595a 8.486±0.395ab 36.565＊＊

3 讨论

肺泡Ⅱ型上皮细胞具有修复功能，通过其自身的钠通道和钠泵来维持肺泡的内环境稳定。同时具有自然免疫功能，在细胞受损或者感染时，肺泡Ⅱ型上皮细胞可以分泌趋化因子和细胞因子而显著增强肺脏的防御能力。肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤必然导致肺泡屏障功能的破坏，引起细菌和病毒的入侵，同时启动肺内局部及全身炎症免疫反应，导致ARDS的发生。因此减轻肺泡Ⅱ型上皮细胞的损害，维持其正常结构和功能在治疗ARDS过程中起着重要作用。

非神经性乙酰胆碱及其受体表达于肺泡上皮细胞，其作用是调节这些非神经依赖细胞的基本生物学功能：增殖、凋亡、细胞因子的释放等。盐酸戊乙奎醚具有选择性M1、M3和N1、N2受体拮抗作用，对外周有很强的抗胆碱作用［4］。研究表明在心肺转流术中盐酸戊乙奎醚可能通过调节肠内微循环，保护肠黏膜屏障，抑制全身炎症反应［5］。动物研究结果显示盐酸戊乙奎醚抑制P38MAPK和NF-kappaB的激活，减轻氧化应激反应、炎症反应和凋亡，从而对肾脏缺血再灌注损伤发挥保护作用［6］。此外也可上调肺组织内的水通道蛋白5（AQP5）的表达，减轻肺水肿，减轻肺脏气体交换损害和肺组织形态学变化。盐酸戊乙奎醚的应用可以上调实验动物肺内β-arrestins的表达从而减轻肺毛细血管的通透性，同时使肺内髓过氧化物酶（MPO）活性显著下降、降低血管黏附分子-1的表达［7］。而抗胆碱能药物盐酸戊乙奎醚对肺泡上皮细胞是否具有保护作用尚少见报道。

本研究设想盐酸戊乙奎醚对肺泡上皮细胞通过氧化应激具有保护作用。氧化应激损伤是导致肺部疾病的重要病理生理基础，因此通过氧化应激建立肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤模型，检测MDA、SOD、GSH和NADPH含量来证实。MDA是生物膜脂质过氧化反应最重要的代谢产物之一，其含量水平反映了组织中氧自由基含量及细胞损伤程度的水平。SOD、GSH是体内重要的内源性抗氧化剂，NADPH作为体内重要的供氢体，主要参与多种活性物质的合成与转化，它的耗竭使得细胞内多种物质的生物合成受到障碍，其水平可间接反映细胞抗氧化损伤的能力。本研究结果显示预先给予盐酸戊乙奎醚可减轻过氧化氢对肺泡Ⅱ型细胞的损伤作用，抑制MDA的形成，增加SOD、GSH和NADPH含量，减轻氧化损伤，提高细胞存活率，减低细胞凋亡指数。从细胞水平证实体外氧化应激损伤时，盐酸戊乙奎醚对肺泡Ⅱ型细胞具有保护作用。此外，与对照组比较，P组的MDA水平明显增高，SOD、GSH和NADPH含量下降，说明盐酸戊乙奎醚仅能部分减轻氧化损伤，不能完全阻断损伤。但其机制还不是很清楚，有待进一步研究。

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（2014-08-21收稿 2015-02-12修回）

（本文编辑 魏杰）

Protective effects of penehyclidine hydrochloride on A549 cells against oxidative injury

DU Xueke，PAN Linghui，PEI Shenglin，GE Wanyun
Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

ObjectiveTo explore the effects of penehyclidine hydrochloride（PHC）on lung epithelial typeⅡcells against oxidative stress damage.MethodsA549 cells treated with H2O2were used as oxidative stress damage cell model. A549 cells were divided into 3 groups:control group（C group），H2O2treated group（H group）and PHC treated group（P group）.The viability of A549 cells was measured by MTT assay.The apoptotic rate was measured by TUNEL assay.The lev⁃els of malonicdialed（MDA），reactive oxygen species（SOD），reduced glutathione hormone（GSH）and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）of cells were detected by biochemistry colorimetry.ResultsCompared with group C，the viability of A549 and the contents of SOD，GSH and NADPH were significantly decreased in group H，while MDA content and apoptotic rate were increased（P＜0.05）.Compared with group H，the viability of A549，the contents of SOD，GSH and NADPH were significantly increased in group P，while MDA content and apoptotic rate were reduced（P＜0.05）.Conclu⁃sionPenehyclidine hydrochloride shows protective effects on A549 cells through reducing the oxidative damage induced by H2O2.

penehyclidine hydrochloride；lung epithelial typeⅡcells；A549；oxidative stress damage

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.005

广西壮族自治区自然科学基金青年基金项目（2013GXNSFBA019182）

广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科（邮编530021）

杜学柯（1981），男，主治医师，主要从事呼吸急救方面研究