利拉鲁肽对2型糖尿病阿尔茨海默病样三重转基因小鼠学习记忆的影响

孙洁，陈书仪，路素素，郑军，邓艳秋

实验研究

利拉鲁肽对2型糖尿病阿尔茨海默病样三重转基因小鼠学习记忆的影响

孙洁，陈书仪，路素素，郑军，邓艳秋△

目的研究2型糖尿病（T2DM）对阿尔茨海默病（AD）样APP/PS1/Tau三重转基因（3×Tg）小鼠学习记忆能力的影响和利拉鲁肽（LIR）对此模型神经保护作用的相关机制。方法将1月龄C57BL/6小鼠设为正常对照（WT）组，1月龄3×Tg小鼠分为对照（Tg）组、单纯利拉鲁肽（Tg+LIR）组、Tg+T2DM组、T2DM+利拉鲁肽（Tg+T2DM+LIR）组。T2DM造模方法为喂2个月高脂高糖饲料，然后腹腔注射链脲佐菌素（STZ），空腹血糖大于7 mmol/L为造模成功，腹腔注射LIR治疗2个月。5月龄时测体质量、空腹血糖。Morris水迷宫检测空间学习记忆能力，Western blot⁃ting检测Tau、神经丝（NFs）和胰岛素受体底物（IRS）磷酸化水平。ELISA检测转入的人APP基因表达的人β淀粉样蛋白（Aβ）42，检测LIR对Aβ的影响。结果与Tg组比较，Tg+T2DM组小鼠质量、空腹血糖、逃避潜伏期、pT231、pT181、SMI31、Aβ42增加，穿越隐匿平台次数及pIRS减少。LIR能减轻高脂高糖饮食及T2DM造成的体质量和血糖的增加，能缓解T2DM对3×Tg小鼠空间学习记忆能力的损伤，改善T2DM对3×Tg小鼠Tau、NFs及IRS蛋白磷酸化的影响，减少3×Tg小鼠的Aβ沉积。结论T2DM会加重3×Tg小鼠的AD样症状，而LIR对其有保护作用。

阿尔茨海默病；糖尿病，2型；淀粉样β蛋白；胰岛素抵抗；利拉鲁肽；Tau；胰岛素受体底物；神经丝

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以学习记忆和认知功能进行性减退为主要特征的神经退行性疾病，其显著病理学特征是主要成分为β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的老年斑、异常过度磷酸化的微管相关蛋白Tau和骨架蛋白神经丝（neurofila⁃ments，NFs）组成的神经原纤维缠结。2型糖尿病（T2DM）与AD有密切关联，胰岛素信号通路相关蛋白功能障碍可能是T2DM和AD的共同发病基础［1］。流行病学调查显示T2DM导致AD的患病风险增加了约2～5倍［2-4］。轻度认知功能障碍及AD患者正电子发射型计算机断层显像（PET-CT）结果显示局部脑区糖代谢减少［5］。脑内糖代谢紊乱及Aβ的神经毒性可能是AD主要初始病因［6-7］。近年来，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物利拉鲁肽（Liraglu⁃tide，LIR）对神经系统的保护作用得到证实［8］。本研究在AD样三重转基因（3×Tg）小鼠的基础上建立T2DM模型，旨在探讨T2DM对AD样小鼠的影响及利拉鲁肽对神经系统保护作用的相关机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与分组清洁级野生C57BL/6小鼠8只（购自中国医学科学院放射医学研究所），APP/PS1/Tau三重转基因小鼠32只（购自美国MRRC实验室），鼠龄1月龄，体质量10～14 g，野生组为正常对照（WT）组，三重转基因组按随机数字表法分为对照（Tg）组、单纯利拉鲁肽（Tg+LIR）组、T2DM模型（Tg+T2DM）组、T2DM+利拉鲁肽治疗（Tg+T2DM+LIR）组，每组8只，按标准实验动物饲养。

1.1.2主要仪器与试剂高脂高糖饲料成分为10%猪油、20%蔗糖、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.2%胆盐和普通饲料成分；链脲佐菌素（STZ）购于Sigma公司；利拉鲁肽购于诺和诺德制药有限公司；Tau5抗体、Tau［pT231］抗体、人β淀粉样蛋白42（human Aβ42）酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒均购于美国Invitrogen公司；P-IRS抗体和Tau［pT181］抗体购于Cell Signaling Technologies；SMI31抗体购于美国Sternberger公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体和羊抗兔抗体购于英国Abcam公司。β-actin抗体和ECL化学发光试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1造模和给药T2DM模型为从1月龄开始喂高脂高糖饲料2个月，3月龄时腹腔注射1次小剂量STZ，STZ用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.2）配成浓度为1%的溶液，注射剂量为150 mg/kg，注射前小鼠禁食16 h。对照组喂普通饲料，注射等剂量生理盐水。从注射STZ后第3天测空腹血糖，高于7 mmol/L为造模成功，可开始腹腔注射利拉鲁肽治疗，剂量为300 μg/kg，持续治疗2个月，每天上午注射1次，其他组用等剂量生理盐水，在小鼠5月龄时开始检测各指标。

1.2.2空腹血糖检测小鼠治疗2个月后，禁食10 h，尾静脉采血，使用强生血糖仪测量。

1.2.3Morris水迷宫实验在治疗第55天开始连续6 d的水迷宫实验。前5 d定位航行实验：将小鼠面朝池壁分别由4个入水点依次放入水中，记录小鼠从入水到找到隐藏在水下的平台的逃避潜伏期。第6天撤掉平台进行空间探索实验：将小鼠从4个入水点依次放入水中，记录小鼠在60 s内穿越之前隐匿平台位置的次数。

1.2.4Western blotting小鼠处死后快速取脑，-80℃保存。用PIPA裂解液（含PMSF，cocktail蛋白酶抑制剂）匀浆，然后用BCA蛋白定量法测量，酶标仪562 nm测量蛋白浓度，通过不同浓度蛋白标准品计算出公式，然后计算出各组样品蛋白浓度，再加入不同体积的上样缓冲液和水，使各组蛋白等量。SDS-PAGE电泳，再用PVDF膜湿转，5%BSA封闭后，一抗4℃过夜，二抗室温1.5 h，ECL发光、显影、定影。Im⁃age J软件分析各检测结果，用Tau5和β-actin做内参。Tau［pT231］抗体和Tau［pT181］检测Tau蛋白在231和181位点的磷酸化水平，以Tau5做内参；P-IRS抗体检测胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）磷酸化水平，SMI31抗体检测NFs重链和中链的磷酸化水平，均以β-actin做内参。

1.2.5ELISA按human Aβ42 ELISA试剂盒说明书逐步操作，主要步骤包括加入标准品和样品（小鼠脑组织），加入抗体，冲洗，加缓冲液和终止液，450 nm酶标仪检测脑组织中Aβ42的含量。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较方差齐用LSD-t法，方差不齐用Tamhane′s T2法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1体质量及空腹血糖结果在5月龄时，WT组、Tg组、Tg+LIR组的体质量、空腹血糖比较差异均无统计学意义。而Tg+T2DM组体质量和空腹血糖较Tg组增加（P＜0.05），Tg+T2DM+LIR组治疗后体质量和空腹血糖较Tg+T2DM组降低（P＜0.05），见表1。

Tab.1Comparison of body weight and fasting blood glucose between five groups of mice表1 小鼠体质量和空腹血糖比较（n=8，）

Tab.1Comparison of body weight and fasting blood glucose between five groups of mice表1 小鼠体质量和空腹血糖比较（n=8，）

＊P＜0.05；a与Tg组比较，b与WT组比较，c与Tg+T2DM组比较，P＜0.05；表2～4同

组别WT组Tg组Tg+LIR组Tg+T2DM组Tg+T2DM+LIR组F体质量（g）27.63±2.30 28.65±2.28 28.48±2.30 34.91±3.00ab31.84±2.11c12.580＊空腹血糖（mmol/L）4.85±0.64 5.13±0.86 4.84±0.71 10.74±1.88ab7.73±1.50c35.913＊

2.2Morris水迷宫结果

2.2.1定位航行实验逃避潜伏期比较显示，5月龄的Tg组、Tg+LIR组、WT组差异无统计学意义。训练第2天Tg+T2DM组逃避潜伏期较Tg组增加（P＜0.05），Tg+T2DM组与WT组比较差异无统计学意义。但从训练第3天开始，Tg+T2DM组逃避潜伏期较WT组和Tg组均增加（P＜0.05），其寻找平台的方式中边缘式和随机式增多。Tg+T2DM+LIR组治疗后与Tg+T2DM组相比逃避潜伏期减少（P＜0.05），见表2。

Tab.2Comparison of mean escape latency in place navigation test between five groups of mice表2 小鼠定位航行平均逃避潜伏期的比较（n=8，s，）

Tab.2Comparison of mean escape latency in place navigation test between five groups of mice表2 小鼠定位航行平均逃避潜伏期的比较（n=8，s，）

组别WT组Tg组Tg+LIR组Tg+T2DM组Tg+T2DM+LIR组F第1天43.97±12.06 41.00±11.68 41.56±13.08 44.53±12.51 40.06±10.29 0.209第2天32.19±9.33 24.50±4.30 34.69±11.61 40.78±7.96a 34.44±10.48 3.334＊组别WT组Tg组Tg+LIR组Tg+T2DM组Tg+T2DM+LIR组F第3天23.00±7.37 19.44±7.61 22.75±9.08 33.09±11.26ab 23.44±8.80c 2.651＊第4天19.28±5.46 18.28±6.22 16.81±5.54 27.09±3.20ab 20.60±3.77c 5.133＊第5天14.34±3.53 15.13±5.10 14.72±4.33 20.25±6.49ab 12.97±4.16c 2.663＊

2.2.2空间探索实验WT组、Tg组、Tg+LIR组穿越隐匿平台次数差异无统计学意义，而Tg+T2DM组较Tg组减少（P＜0.05），Tg+T2DM+LIR组治疗后较Tg+T2DM组增多（P＜0.05），见表3。

Tab.3Comparison of the number of crossing hidden platform and levels of human Aβ42 in brain tissue between five groups of mice表3 小鼠穿越隐匿平台次数和脑组织中的human Aβ42水平的比较（n=8，）

Tab.3Comparison of the number of crossing hidden platform and levels of human Aβ42 in brain tissue between five groups of mice表3 小鼠穿越隐匿平台次数和脑组织中的human Aβ42水平的比较（n=8，）

组别WT组Tg组Tg+LIR组Tg+T2DM组Tg+T2DM+LIR组F穿越隐匿平台次数4.16±0.53 4.22±0.66 4.03±0.97 3.03±0.51ab4.13±0.61c4.319＊Aβ42（ng/g）-30.76±1.48 22.17±2.27a37.38±1.83a31.80±2.17c32.500＊

2.3Western blotting结果5月龄的Tg组与WT组pT231、pT181、SMI31及pIRS的表达差异无统计学意义，Tg+T2DM组pT231、pT181和SMI31表达较Tg组和WT组增多，Tg+T2DM+LIR组治疗后较Tg+ T2DM组减少（均P＜0.05）。Tg+T2DM组pIRS表达较Tg组和WT组降低，Tg+T2DM+LIR组治疗后较Tg+T2DM组增高（均P＜0.05），见图1，表4。

Fig.1The expression levels of phosphorylated Tau，NF-HM and IRS图1 Tau、神经丝重链和中链、IRS的磷酸化水平的表达

Tab.4Comparison of phosphorylated Tau，NFs and IRS between five groups of mice表4 Tau、NFs和IRS磷酸化水平的比较（n=3，）

Tab.4Comparison of phosphorylated Tau，NFs and IRS between five groups of mice表4 Tau、NFs和IRS磷酸化水平的比较（n=3，）

组别WT组Tg组Tg+T2DM组Tg+T2DM+LIR组F pT231 0.58±0.04 0.57±0.08 0.97±0.02ab 0.71±0.07c 32.993＊pT181 0.40±0.02 0.39±0.08 0.94±0.02ab 0.74±0.03c 118.772＊SMI31 0.53±0.03 0.67±0.07 0.96±0.03ab 0.73±0.06c 43.370＊pIRS 0.72±0.06 0.72±0.08 0.36±0.03ab 0.50±0.02c 35.921＊

2.4ELISA结果野生型小鼠不存在人APP基因，未检测到human Aβ42。Tg+LIR组Aβ42较Tg组减少，Tg+T2DM组较Tg组增多，Tg+T2DM+LIR组较Tg+T2DM组减少（均P＜0.05），见表3。

3 讨论

中枢神经系统胰岛素信号传导系统正常才能维持颅内血液及能量代谢正常［9］，长时间的高血糖状态及胰岛素抵抗状态会增加轻度认知功能障碍的患病率，增加神经退行性疾病的患病风险［10］。胰岛素信号传导系统与脑内葡萄糖代谢和能量产生、细胞内外Aβ的聚集、Tau和NFs过度磷酸化、神经元及神经祖细胞凋亡、氧化应激及坏死有关［11-12］。而且，Aβ寡聚体会和胰岛素竞争结合胰岛素受体，使其磷酸化降低，影响其正常信号传导功能［1］。

3×Tg小鼠3个月时可在皮质区的细胞内检测到Aβ，6个月时可在皮质区细胞外和海马CA1区检测到，且6个月开始出现认知功能障碍，磷酸化的Tau蛋白逐渐增多，且一直是伴随在Aβ之后出现，其病理进程与人类AD相似，是目前研究此类疾病的最佳动物模型［13］。本研究显示：Tg组5月龄3×Tg小鼠在水迷宫实验中的逃避潜伏期和穿越隐匿平台次数与野生小鼠没有显著差异，而Tg+T2DM组患有T2DM的3×Tg小鼠在5月龄时即与野生小鼠有差异，说明T2DM会加速AD的病理进程，而利拉鲁肽能延缓T2DM对AD的影响，对小鼠的空间记忆能力有保护作用。Western blotting检测结果说明5月龄Tg组和WT组小鼠的Tau、NFs和IRS蛋白的磷酸化水平的差异不大，但T2DM能增高5月龄3×Tg小鼠的Tau和NFs蛋白的磷酸化水平，降低IRS磷酸化水平，利拉鲁肽治疗后可缓解T2DM对转基因小鼠Tau、NFs及IRS蛋白的磷酸化水平的影响。ELISA结果显示利拉鲁肽可降低转基因小鼠的Aβ的沉积，亦可缓解T2DM加速转基因小鼠Aβ沉积而造成的不良影响。本实验结果显示利拉鲁肽可能通过调节IRS磷酸化水平来改善胰岛素信号传导系统，调节脑内糖代谢，进一步影响Tau和NFs蛋白的表达量，且可以通过降低Aβ的沉积而降低其神经毒性，表明利拉鲁肽可能会成为治疗目前认为是脑内糖代谢紊乱及Aβ神经毒性为主要初始AD病因的有效药物。

临床上，T2DM患者可能会出现认知功能障碍等症状，然而AD患者也可能会出现高血糖、高胆固醇血症及胰岛素抵抗等症状；动物实验表明T2DM与AD模型在行为、认知和血管形态等方面存在相似处，提示这两种疾病之间可能互为因果［14］。T2DM和AD有很多相似的病理特征和生理功能上的改变，例如T2DM和AD都有淀粉样蛋白的沉积，都有细胞骨架蛋白的异常磷酸化，都有胰岛素信号传导的异常。有实验研究显示胰岛素可以改善AD样小鼠学习记忆能力［15］，因此，利用GLP-1改善AD患者胰岛素信号通路是一个很重要的治疗环节。GLP-1可通过血脑屏障在相应脑区与GLP-1R结合而发挥作用。人工合成的GLP-1类似物利拉鲁肽抵抗二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）降解的能力增强，血清半衰期可达12～24 h。GLP-1的神经保护作用也得到证实，如GLP-1R基因敲除的小鼠的学习记忆出现损伤，GLP-1类似物能减轻APP/PS1小鼠突触的丢失，保护突触可塑性，减轻脑内Aβ的沉积和炎症反应，促进齿状回神经前体细胞的增殖［8，16-17］。

综上所述，GLP-1类似物可改善转基因小鼠学习记忆能力及脑组织的神经退行性变，其机制可能与改善胰岛素信号通路，降低Aβ有关，但其更广泛的作用机制及具体的信号通路还不明确，尚待进一步的研究。

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（2015-01-21收稿 2015-03-23修回）

（本文编辑 李国琪）

The effects of liraglutide on learning and memory in Alzheimer-like triple transgenic mice with type 2 diabetes

SUN Jie，CHEN Shuyi，LU Susu，ZHENG Jun，DENG Yanqiu△
Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Science，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

ObjectiveTo investigate the effects of type 2 diabetes on learning and memory of APP/PS1/Tau triple transgenic（3×Tg）mice of Alzheimer’s disease，and the protective mechanism of liraglutide（LIR）thereof.MethodsOne month old C57BL/6 mice were set to be control group（WT）.One month old 3×Tg mice were divided into control group（Tg），liraglutide group（Tg+LIR），type 2 diabetes group（Tg+T2DM）and liraglutide treatment group（Tg+T2DM+LIR）.The model of T2DM was established by feeding the high fat and sugar fodder，and then injecting streptozotocin（STZ）in mice，making sure the fasting blood glucose was more than 7 mmol/L.Then the subcutaneous injection of LIR was administered for 2 months.The values of body weight and fasting blood glucose were detected at age of 5-month.Morris water maze was applied to evaluate the spatial learning and memory ability.Western blotting assay was used to measure the levels of phosphorylated Tau，neurofilament（NFs）and insulin receptor substrates.ELISA was used to detect the human Aβ 42 to evaluate the effect of LIR on-amyloid.ResultsLIR can reduce body weight and blood glucose，can alleviate spatial learning and memory damaging caused by T2DM，and also can improve phosphorylated Tau levels，NFs and insulin receptor substrates caused by T2DM，and finally can reduce the deposition of β-amyloid of 3×Tg mice.ConclusionT2DM can aggravate symptoms of AD in 3×Tg mice，and LIR has a protective effect on it.

Alzheimer disease；diabetes mellitus，type 2；amyloid beta-protein；insulin resistance；liraglutide；Tau；insulin receptor substrate；neurofilaments

R742

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.007

国家自然科学基金资助项目（81270422）

天津医科大学基础医学院生理学与病理生理学教研室（邮编300070）

孙洁（1988），女，硕士在读，主要从事神经退行性变研究

△通讯作者E-mail:dengyanqiu66@gmail.com