莲心碱促进膀胱癌5637细胞凋亡增强Caspase-7表达及活化

徐宾，张天禹△，谭宁，闫亓，徐伶俐，刘晓佳，高漓

莲心碱促进膀胱癌5637细胞凋亡增强Caspase-7表达及活化

徐宾1，张天禹1△，谭宁2，闫亓1，徐伶俐3，刘晓佳4，高漓1

目的研究莲心碱（Liensinine）对膀胱癌细胞株5637凋亡的影响，初步探讨其作用机制。方法使用CCK-8法及克隆形成实验检测莲心碱对5637细胞增殖的抑制作用；通过流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法测定莲心碱对5637细胞凋亡的影响；采用Western blot技术分析细胞凋亡相关基因Caspase-7表达状况。结果CCK-8法及克隆形成实验结果均表明莲心碱对膀胱癌细胞5637增殖有明显的抑制作用，并呈剂量-效应关系。流式细胞术结果提示莲心碱可使膀胱癌5637细胞发生早期凋亡；Western blot检测结果显示莲心碱增强5637细胞Caspase-7表达并促进其活化。结论莲心碱可抑制5637细胞增殖，使其发生早期凋亡，其作用机制可能与促进Caspase-7表达及活化有关。

膀胱肿瘤；生物碱类；细胞增殖；细胞凋亡；半胱氨酸内肽酶类；莲心碱；Caspase-7

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，而非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）约占膀胱癌的80%［1］，治疗以经尿道膀胱肿瘤电切术辅以术后灌注化疗为主。但目前的化疗药物并不能很好地解决膀胱肿瘤术后易复发的问题。寻求疗效更好、不良反应少的灌注治疗药物，一直是泌尿外科的研究热点。莲心碱（Liensinine）是从莲子的胚芽中提取出的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有降血压、抗心律失常、抗脂质过氧化，抗血小板凝集、抗血栓及保护心脑血管活性等作用［2］。此外，本课题组先前研究发现，莲心碱具有抑制膀胱癌T24细胞增殖及细胞周期阻滞的作用［3］。为进一步了解莲心碱对膀胱癌5637细胞凋亡的影响，笔者以人膀胱癌细胞株5637为实验对象，对其作用机制进行初步探讨，以期为膀胱癌术后临床治疗提供新的备选方案及理论基础。

1 材料与方法

1.1材料人膀胱癌5637细胞株购于中国科学院上海生科院细胞资源中心，莲心碱（上海源叶有限公司，货号为YY90562 CAS:#25.00086-96-1，莲心碱溶于甲醇，制成20 g/L储备液），DMEM高糖培养液（GIBCO公司，货号：C11995500BT），胎牛血清FBS（Corille公司，货号：C1015-05），CCK-8试剂（上海同仁化学研究所，货号：CK04），Cas⁃pase-7单克隆抗体（CST公司，货号：12827），β-actin（鼠源性，SANTA CRUZ公司），AnnexinV-FITC/PI试剂（东仁化学科技上海有限公司，货号：AD10）。

1.2细胞培养人膀胱癌细胞5637培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中（含青链霉素），用0.25%的胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期的肿瘤细胞进行实验。

1.3细胞增殖实验采用对数生长期膀胱癌5637细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%FBS的DMEM培养液将细胞吹打为单细胞悬液，以1 000个/孔浓度接种于96孔板。24 h细胞贴壁后，加入莲心碱使其终浓度为1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L，对照组加等体积甲醇，同一浓度设置3个复孔。检测前，弃去培养基，在每孔加入100µL CCK-8检测试剂，37℃孵育2 h后，置于连续波长酶标仪（infinite M200 PRO），读取450 nm波长处吸光度（A）值，分别记录加药后2 h及第1、2、3、4天数值。然后计算出莲心碱2、3、4 d的半数抑制浓度（IC50）值及各时间点的细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（对照组A450值-干预加药组A450值）/对照组A450值×100%。

1.4克隆形成实验6孔培养板接种1 200个处于对数生长期的人膀胱癌5637细胞。37℃、5%CO2孵育24 h后，加入药液使莲心碱终浓度为1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L，待药物作用5637细胞达7 d后。弃去上清液，PBS溶液浸洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，弃固定液，加入结晶紫染液染色15 min，洗去染液，空气中干燥，扫描图像。然后加入10%冰醋酸溶液2 mL，静置30 min，结晶紫溶解后，取100µL加入96孔板中，使用连续波长酶标仪（infinite M200 PRO），读取各孔560 nm波长处A值并计算克隆抑制率。克隆抑制率（%）=（对照组A560值-干预加药组A560值）/对照组A560值×100%。

1.5细胞凋亡检测用10 cm培养皿接种2×105个处于对数生长期的5637细胞，37℃、5%CO2孵育24 h，待贴壁后，加入莲心碱使其浓度为1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L。待药物作用于5637细胞48 h后，收集细胞并离心、弃上清液，PBS洗涤2次，离心，弃上清液，1×结合缓冲液重悬细胞，并吹打混匀，加入5µL AnnexinV/FITC和10µL PI染色液（20 mg/L），避光30 min。筛网过滤，使用流式细胞仪（BD FACS AriaⅢ）测定采集数据。

1.6Western blot检测收集培养细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。经聚丙烯酰胺凝胶（12%分离胶＋6%浓缩胶）电泳后转移至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗37℃孵育2 h，TBST洗涤，与免疫印迹化学发光试剂（ECL）反应，X线片曝光，显影，定影。

1.7统计学方法采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计学处理，以上实验均重复3次。计量资料以均数±标准差表示，多个样本间的均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Bonferroni-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1莲心碱具有抑制5637细胞增殖的作用莲心碱作用2 h后各浓度加药组与对照组比较差异无统计学意义（F=2.778，P＞0.05）。莲心碱作用1 d后（F=58.86，P＜0.05），1.562、3.125、6.250 mg/L各浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05），12.500、25.000 mg/L莲心碱组与其他组间差异有统计学意义（P＜0.05）。莲心碱作用2、3、4 d后，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（F值分别为151.217、170.535、195.366，P＜0.05），见图1。分别用1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L莲心碱作用2 d后，5637细胞增殖抑制率分别为（11.51±0.07）%、（21.31±0.04）%、（29.97±0.43）%、（49.98±0.05）%、（60.38±0.03）%，差异有统计学意义（F=51.786，P＜0.05）。药物作用2、3、4 d后，CCK-8法求得5637细胞IC50值分别为22.36、7.37、6.40 mg/L。

Fig.1Liensinine inhibited the proliferation of 5637 cells in dosedependent manner图1 莲心碱以剂量依赖的方式抑制5637细胞增殖

2.2莲心碱对克隆形成的抑制作用（1）莲心碱各加药组与对照组克隆形成抑制率比较差异有统计学意义（F=120.628，P＜0.05）。（2）1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L莲心碱作用7 d后，克隆抑制率分别为（35.04±0.04）%、（50.32±0.01）%、（68.10± 0.02）%、（84.39±0.01）%、（92.74±0.01）%，差异有统计学意义（F=386.879，P＜0.05），见图2。

2.3莲心碱促进膀胱癌5637细胞凋亡见图3。5637细胞在不同浓度莲心碱干预后，与对照组相比，细胞早期凋亡比例明显增加，对照组及1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L加药组早期凋亡细胞所占比例分别为（2.77±0.09）%、（3.40±0.10）%、（3.57±0.09）%、（4.50±0.15）%、（5.07±0.15）%、（9.63± 0.12）%，差异有统计学意义（F=442.442，P＜0.05）。加药组对5637细胞凋亡具有促进作用。

2.4莲心碱上调膀胱癌5637细胞Caspase-7表达水平莲心碱组与对照组相比，Caspase-7表达及其活化水平在莲心碱干预后出现明显上调，见图4。

Fig.2Liensinine inhibited colony formation of 5637 cells图2 莲心碱抑制5637的细胞克隆形成

Fig.3Liensinine promoted the apoptosis of bladder cancer 5637 cells图3 莲心碱促进膀胱癌5637细胞凋亡

Fig.4Liensinine up-regulated the expression of Caspase-7 and promoted its activation图4 莲心碱上调5637细胞Caspase-7蛋白表达及其活化水平

3 讨论

膀胱癌发病率呈现逐年增长趋势，2008年以来，60岁以上的中国人膀胱癌发病率已超过肾肿瘤，居泌尿系统肿瘤发病率第1位［4］。当前，膀胱癌的防治形势更加严峻，鉴于其术后复发率高，目前临床一线用药如吡柔比星、卡介苗等并不能有效控制复发，寻求术后有效治疗药物十分必要。有关莲心碱的研究表明其具有保护心脑血管活性的作用［5］，但是其在膀胱癌治疗方面的研究少有报道。

本研究采用了CCK-8法及克隆形成实验检测莲心碱对5637细胞增殖的抑制作用。CCK-8法结果表明莲心碱对膀胱癌5637细胞增殖有明显的抑制作用，随药物浓度的增加，抑制作用更加明显。克隆形成实验表明随药物浓度的增加，克隆抑制率呈现明显的升高趋势，药物作用7 d后，3.125 mg/L抑制率即可达到50%，上述结果均表明莲心碱对膀胱癌5637细胞增殖的抑制作用明显，体现了莲心碱良好的体外抗肿瘤效应。

细胞凋亡与细胞增殖的平衡状态可保证细胞数目的稳定，而细胞凋亡的抑制则可能引起肿瘤的产生［6-7］。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的作用靶点之一，许多抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用也是通过诱导细胞凋亡的机制来实现的［8］。细胞凋亡率是评价药物抗癌效果的一项指标［9］。本研究通过不同浓度莲心碱作用于膀胱癌5637细胞发现，随莲心碱浓度的增加，5637细胞早期凋亡率逐渐上升，这表明莲心碱可以促进膀胱癌5637细胞的凋亡，且该促进作用主要发生在细胞凋亡的早期阶段。

Caspase是一类在细胞凋亡过程中起到核心作用的蛋白酶，是细胞凋亡信号转导途径的关键效应分子，也是多种细胞凋亡途径中的共同作用因子，细胞凋亡程度与其表达水平的高低有关［10］。Caspase已经在多种细胞系中被证实可在凋亡的起始和执行阶段被激活［11］。Caspase-7是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，它和Caspase-3共同被认为是凋亡的最终执行者。有研究发现Caspase-7的变异与中国东部地区胃癌易感性相关［12］。人体的多种肿瘤如胃癌、结肠癌及肺癌［13-14］等都有Caspase-7的低表达或变异。本研究结果表明，莲心碱可以通过促进Caspase-7的表达和活化来诱导膀胱癌5637细胞的凋亡。

综上所述，莲心碱可能通过上调Caspase-7的表达及活化，促进膀胱癌5637细胞发生早期凋亡，从而抑制膀胱癌细胞的增殖。莲心碱的体外抗肿瘤作用为膀胱癌的治疗提供了新思路，具有成为膀胱癌治疗药物的潜力。但本研究为体外实验，不能完全模拟复杂的体内环境。因此，莲心碱对膀胱癌的治疗作用需要进一步的动物实验及相关临床试验的证实。

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（2015-01-15收稿 2015-04-23修回）

（本文编辑 魏杰）

Liensinine promotes apoptosis of bladder cancer 5637 cells and enhances Caspase-7 expression and activation

XU Bin1，ZHANG Tianyu1△，TAN Ning2，YAN Qi1，XU Lingli3，LIU Xiaojia4，GAO Li1
1 Department of Urology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541004，China；2 Center of Science Research，Guilin Medical University；3 Department of Gastroenterology，4 Department of Pathology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University△

ObjectiveTo study the effects of Liensinine on apoptosis of 5637 cells，and its mechanism thereof.Meth⁃odsCCK-8 method and the colony formation test were used to detect cell viabilities，and then inhibition rates were calcu⁃lated.Flow cytometry was used to detect the effects of Liensinine on apoptosis of 5637 cells.Western blot assay was used to detect Caspase-7 protein expression.ResultsCCK-8 assay and colony formation test indicated that Liensinine inhibited the cell proliferation significantly.Results of flow cytometry indicated that Liensinine induced early apoptosis of 5637 cells. Western blot assay showed that Liensinine improved the expression of Caspase-7 and enhanced the activation of Caspase-7 in 5637 cells.ConclusionLiensinine could inhibit the proliferation of 5637 cells，induce early apoptosis，which may be re⁃lated with the enhanced expression of Caspase-7 and its activation.

urinary bladder neoplasms；alkaloids；cell proliferation；apoptosis；cysteine endopeptidases；liensinine；Caspase-7

R737.14

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.006

国家自然科学基金资助项目（81360377）；广西自然科学基金项目（2010GXNSFA183013）；桂林市科学研究与技术开发项目（20080408）

1桂林医学院附属医院泌尿外科（邮编541004）；2桂林医学院科学实验中心；3桂林医学院附属医院消化内科；4桂林医学院附属医院病理科

徐宾（1986），男，硕士研究生，主要从事泌尿系肿瘤研究

△通讯作者E-mail：zhangtianyu64@qq.com