体外诱导人牙龈成纤维细胞多向分化潜能的实验研究

蒋少云，陶玉飞，李阳，宋立婷，朱东望，邓嘉胤

体外诱导人牙龈成纤维细胞多向分化潜能的实验研究

蒋少云，陶玉飞，李阳，宋立婷，朱东望，邓嘉胤△

目的探索人牙龈成纤维细胞（hGFs）是否具有多向分化潜能，为组织工程学提供新的细胞来源。方法经志愿者知情同意后收集健康牙龈组织，组织块法培养hGFs。取第3代hGFs进行成骨、成软骨和成脂诱导，未分化诱导的细胞为对照组。分别用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色、阿利新蓝染色、油红O染色检测细胞成骨、成软骨和成脂能力。实时定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞中成骨分化标志基因ALP、runt相关转录因子2（Runx2）、成软骨分化标志基因聚集蛋白聚糖（AGR）和成脂分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）的表达。结果成骨诱导组培养至7 d时ALP染色可见大量的蓝紫色沉淀，28 d时细胞周围有大量红染的钙结节沉积，而对照组无钙结节，培养至14 d细胞中ALP和Runx2表达明显高于对照组（P＜0.01）。14 d时成软骨诱导组阿利新蓝阳性，成脂诱导组可见红色的脂肪滴，而对照组2种染色为阴性，AGR、PPARγ2表达均明显高于对照组（P＜0.01）。结论hGFs具有成骨、成软骨和成脂分化的多向分化潜能。

牙龈；成纤维细胞；成脂分化；细胞分化；人牙龈成纤维细胞；成骨分化；成软骨分化

牙周炎的重要病理变化之一是牙槽骨的吸收，如何促进牙周骨缺损再生是牙周治疗的难题，采用组织工程学获得牙周骨再生是研究的热点。目前研究较多的口腔来源细胞包括牙周膜细胞、牙髓干细胞和牙囊细胞等［1-3］，但是由于这些细胞取材困难，增殖分化数量少等，临床应用的可能性相对较低。人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，hGFs）是牙龈组织中的主要细胞成分。研究发现hGFs不但参与炎症反应［4］，而且从人牙龈组织中分离的间充质干细胞或hGFs能够在体外诱导下表达多种成骨相关基因［5-6］。但至今尚鲜见文献直接证实hGFs具有多向分化的潜能。本研究旨在探索hGFs在体外培养条件下是否具有成骨、成软骨和成脂分化的能力，为确定hGFs作为组织工程的种子细胞提供依据。

1 材料与方法

1.1材料DMEM细胞培养液（低糖）、胎牛血清（fetal bo⁃vine serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美国）；青/链霉素、抗坏血酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌、吲哚美辛、地塞米松、L-谷氨酰胺、茜素红（Sigma，美国）；DispaseⅡ分散酶（Roche，德国）；胰岛素、转化生长因子（TGF）-β1、Trizol总RNA提取试剂（Invitrogen，美国）；饱和油红O染色液、阿利新蓝（北京索莱宝公司，中国）；cDNA合成试剂盒、real-time PCR试剂盒（Promega，美国）。5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝（BCIP/NBT）溶液（北京华兴博创生物技术中心，中国）。

1.2方法

1.2.1hGFs体外分离与培养选择就诊于天津医科大学口腔颌面外科的志愿者，年龄18～25岁，无龋病、牙周病，经志愿者知情同意后，于局麻下拔除埋伏阻生齿时获得新鲜健康牙龈组织。组织块经加有双抗的磷酸盐缓冲液反复冲洗后，用2 U/mL无菌中性蛋白DispaseⅡ分散酶4℃浸泡，16～18 h后剥离牙龈上皮组织弃之，剪成体积约为0.5～1 mm3的碎块，将组织块均匀接种于100 mm培养皿中。待组织块于培养皿适当贴合以后，加入DMEM+15%FBS，置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内进行培养，倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。待细胞从组织块中爬出并铺满瓶底达80%融合时进行传代，用DMEM培养基进行培养，取生长良好的第3代细胞用于实验。

1.2.2细胞分化培养取生长良好的第3代hGFs，以2×104/孔接种于6孔板，37℃温箱孵育24 h，待细胞贴壁后，进行细胞分化诱导培养。成骨诱导培养：DMEM培养基（低糖）、3%FBS、1×10-3mol/L β-甘油磷酸钠、5 mg/L抗坏血酸、2×10-3mol/LL-谷氨酰胺以及1×10-7mol/L地塞米松。成软骨诱导培养：DMEM（低糖）、3%FBS、50mg/L抗坏血酸、6.25mg/L胰岛素及10µg/LTGF-β1。成脂诱导培养：包括DMEM（低糖）、3%FBS、1×10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌及2×10-4mol/L吲哚美辛。对照组培养：DMEM（低糖）+3%FBS。

1.2.3碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色按1.2.2所述方法接种细胞后，加入成骨分化培养基，37℃、5% CO2条件下继续培养，每周换2～3次液。培养至7 d的细胞，弃培养基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后，加入BCIP/NBT溶液，室温避光染色30 min，PBS漂洗2次，于直视及倒置显微镜下观察结果。

1.2.4茜素红染色按1.2.3所述方法培养细胞，培养至28 d收集细胞，弃培养基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后加入0.5%茜素红染色液，室温染色30 min，PBS漂洗2次后，于直视及倒置显微镜下观察。

1.2.5阿利新蓝染色如1.2.2所述方法接种细胞后，加入成软骨分化培养基，37℃、5%CO2条件下继续培养，每周换2～3次液。培养至14 d时，弃培养基，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定30 min，加入阿利新蓝染色液，孵育过夜，3%醋酸漂洗3次，每次5 min，PBS漂洗，直视及显微镜下观察结果。

1.2.6油红O染色如1.2.2所述方法接种细胞后，加入成脂分化培养基，37℃、5%CO2条件下继续培养，每周换2～3次液。培养至14 d时，弃培养基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，加入油红O染色液，室温染色10 min，PBS漂洗3 min×2次，于倒置显微镜下观察并记录结果。

1.2.6实时定量PCR如1.2.2所述方法接种细胞，分别加入成骨、成软骨和成脂培养基，37℃、5%CO2条件下继续培养，每周换2～3次液。培养至14 d时，弃培养基，提取总RNA，逆转录合成cDNA，在Applied Biosystems 9700 Thermo⁃cycler（Applied Bio-systems，USA）上用实时定量PCR检测诱导后细胞中ALP、runt相关转录因子2（runt-related tran⁃script factor 2，Runx2）、聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGR）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator-activat⁃ed receptor gamma 2，PPARγ2）的表达，以GAPDH为内参，所得的数据用2-ΔΔCT法［6］进行处理，与相同刺激时间的对照组进行比较分析。引物序列：ALP上游5′-ACCATTCCCACGTC TTCACATTTG-3′，下游5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′；Runx2上游5′-TCTGGCCTTCCACTCTCAGT-3′，下游5′-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3′；AGR上游5′-CGGCCTG⁃GACAAGTGCTAT-3′，下游5′-CCGAAGTGAGGCTGCATAC C-3′；PPARγ2上游5′-AGACAACCTGCTACA AGCCC-3′，下游5′-AGCGGGTGAAGACTCATGTC-3′；GAPDH上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-ATGGTGGTGA AGACGCCAGT-3′。PCR反应参数：95℃2 min，1个循环；95℃持续15 s；60℃持续60 s，40个循环。

1.3统计学方法使用SAS V8软件进行统计分析，计量资料用描述，进行Student’s t检验，检验水准α=0.05。

Fig.1ALP staining in human gingival fibroblasts induced in osteogenic medium图1 hGFs成骨诱导ALP染色

2 结果

2.1ALP染色和茜素红染色培养至7 d的细胞，对照组无明显ALP染色，成骨诱导组细胞内可见大量蓝紫色沉淀，见图1。培养至28 d的细胞，对照组细胞周围无钙结节形成，成骨诱导组可见细胞周围有大量红染的钙结节，见图2。

Fig.2Alizarin red staining in human gingival fibroblasts induced in osteogenic medium图2 hGFs成骨诱导茜素红染色

2.2阿利新蓝染色培养至14 d的细胞，对照组细胞阿利新蓝染色阴性，成软骨诱导组见大量胞质呈蓝染的细胞，见图3。

Fig.3Alcian blue staining in human gingival fibroblasts induced in chondrogenic medium图3 hGFs成软骨诱导阿利新蓝染色

2.3油红O染色加入成脂诱导培养基以后，hGFs表现出细胞表型的变化包括体积变大，形态呈长椭圆形或多角形。培养至14 d的细胞，成脂诱导组培养液中存在漂浮的脂肪颗粒。镜下可见：对照组细胞呈长梭形，油红O染色阴性；成脂诱导组可见部分细胞体积增大，细胞呈类圆形或长椭圆形，细胞质内见大小不一的红色球状脂肪颗粒，见图4。

2.4成骨、成软骨和成脂标志基因的表达成骨诱导14 d后细胞中ALP和Runx2的表达明显高于对照组（P＜0.01），成软骨诱导14 d后细胞中AGR的表达明显高于对照组（P＜0.01），成脂诱导14 d后细胞中PPARγ2的表达明显高于对照组（P＜0.01），见表1。

Fig.4Oil red O staining in human gingival fibroblasts induced in adipogenic medium图4 hGFs成脂诱导油红O染色（×100）

Tab.1ALP，Runx2，AGR and PPARγ2 expressions in hGFs after being induced by differentiation medium表1 hGFs分化培养后ALP、Runx2、AGR和PPARγ2的表达

Tab.1ALP，Runx2，AGR and PPARγ2 expressions in hGFs after being induced by differentiation medium表1 hGFs分化培养后ALP、Runx2、AGR和PPARγ2的表达

＊＊P＜0.01

ALP 1.002±0.069 4.599±0.571组别对照组成骨组成软骨组成脂组t Runx2 1.001±0.050 5.532±0.853 PPARγ2 1.007±0.146 ------10.84＊＊9.19＊＊AGR 1.023±0.251 -5.375±0.624 -11.21＊＊7.224±0.727 14.53＊＊

3 讨论

hGFs来源于人牙龈结缔组织的间充质细胞，具有活跃的自我更新能力，并且具有合成和降解胶原纤维的功能。通过本研究发现：hGFs在体外在一定的条件下能被诱导向成骨、成软骨和成脂分化，说明hGFs可能是一种具有多向分化潜能的细胞。

本研究采用ALP染色和茜素红染色检测hGFs的成骨分化能力。ALP在成骨的过程中可以水解磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供磷酸，可以反映细胞成骨分化趋势，也是检测细胞成骨分化的早期标志之一。本研究显示，在成骨分化诱导7 d后hGFs细胞内见大量蓝紫色沉淀，而且通过检测ALP mRNA水平，发现成骨诱导组细胞中的表达明显高于对照组，与染色结果一致，说明在成骨诱导的早期，hGFs表现出明显的成骨分化趋势。同时Runx2是细胞成骨分化过程中重要且标志性的因子，在成骨分化培养后hGFs细胞内Runx2 mRNA的水平明显升高，说明hGFs已向成骨分化。进一步用茜素红染色进行验证，细胞成骨诱导28 d时茜素红染色显示细胞周围有大量的钙结节形成，证明了hGFs具有成骨分化能力，与Mostafa等［5-7］的研究结果一致。但是，有些研究显示：hGFs无明显成骨分化能力［8-9］。通过比较分析发现：成骨诱导培养基的成分不同可能是导致成骨分化诱导结果存在差异性的主要原因。在Martinez等［8］的研究中成骨诱导培养基的成分中除基础培养基外仅含有β-甘油磷酸钠、抗坏血酸，而在笔者此前研究中发现hGFs在含β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的成骨诱导培养基有较弱的成骨分化能力，但是在培养基中加入适量的地塞米松后，hGFs的成骨分化能力明显增强［10］；笔者的研究与Choi等［9］的研究进行比较，成骨分化培养基成分基本相同，但是某些成分的含量有差异，如胎牛血清、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸，有可能导致研究结果的不一致。

阿利新蓝是细胞成软骨分化的一个重要标志。本研究hGFs经成软骨诱导后阿利新蓝染色阳性，说明hGFs能向成软骨分化，而且成软骨分化标志基因AGR mRNA水平在成软骨诱导组细胞中的表达明显升高，说明在成软骨诱导培养环境中细胞内的成软骨基因表达增强，决定了细胞向成软骨方向分化，与阿利新蓝染色结果一致。

本研究在成脂培养基中hGFs发生了细胞形态的变化，而且在14 d时油红O被细胞内的脂肪滴溶解，出现橘红色油红O染色，而且在成脂分化培养基中细胞内成脂分化标志基因的表达升高，决定了hGFs向成脂分化的方向，从而出现油红O染色阳性的结果，以上均证实了hGFs的成脂分化潜能。

综上，hGFs在不同的分化诱导过程中细胞内的标志性基因发生了相应的变化，驱使细胞向成骨、成软骨或成脂方向分化，而且与其他自体来源的细胞相比，hGFs来源广泛、取材方便、体外培养容易，因此hGFs可能会成为一种新的种子细胞，在组织工程学中具有良好的研究和应用前景。

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（2015-02-27收稿 2015-04-02修回）

（本文编辑 李国琪）

Study on differentiation pluripotency of human gingival fibroblasts induced in vitro

JIANG Shaoyun，TAO Yufei，LI Yang，SONG Liting，ZHU Dongwang，DENG Jiayin△
Department of Periodontics，Hospital of Stomatology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

ObjectiveTo investigate the pluripotency of human gingival fibroblasts（hGFs），and provide a novel cell source for tissue engineering.MethodsWith informed consent from volunteers，fresh and healthy gingiva were collected. The hGFs were obtained from the gingiva by tissue culture.The third passage of hGFs was cultured in osteogenic medium，chondrogenic medium and adipogenic medium.Cells without differentiation were taken as control.Cells were examined by al⁃kaline phosphatase（ALP）staining，Alizarin red staining，Alcian blue staining and oil red O staining for detecting of the abili⁃ty of differentiation pluripotency.Real-time polymerase chain reaction was applied to examine the expression of osteogenic marker genes ALP，runt-related transcript factor 2（Runx2），chondrogenic marker aggrecan（AGR）and adipogenic marker peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2（PPARγ2）.ResultsThe hGFs cultured in osteogenic medium showed massive violet deposit at day 7 and calcium nodulus at day 28，meanwhile，the expressions of ALP and Runx2 were higher than those of control（P＜0.01）.In chondrogenic group cells were found blue deposit at day 14.In adipogenic group lipidfilled droplets stained with oil red O were found in cells at day 14.However，hGFs in control group had no any positive stain⁃ing.Furthermore，expressions of AGR and PPARγ2 were significantly higher than those of control（P＜0.01）.Conclusion Human gingival fibroblasts have the pluripotency of osteogenic，adipogenic and chondrogenic differentiation.

gingiva；fibroblasts；adipogenesis；cell differentiation；human gingival fibroblasts；osteogenic differentia⁃tion；chondrogenic differentiation

R781

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.003

天津市应用基础及前沿技术研究计划-自然科学基金重点项目（12JCZDJC22700）

天津医科大学口腔医院牙周科（邮编300070）

蒋少云（1972），女，副教授，博士，主要从事牙周病发病机制及牙周组织工程学的研究

△通讯作者E-mail:yazhou2991@126.com