Pseudomonas sp. W7产低温蛋白酶培养基及培养条件的优化

康传红，田亚新，李秀凉，董义杰，原继红，王运来，韩晓云,*

（1.黑龙江大学化学化工与材料学院，黑龙江 哈尔滨 150080；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080）

Pseudomonas sp. W7产低温蛋白酶培养基及培养条件的优化

康传红1，田亚新2，李秀凉2，董义杰2，原继红1，王运来2，韩晓云2,*

（1.黑龙江大学化学化工与材料学院，黑龙江 哈尔滨 150080；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080）

采用Plackett-Burman法对影响假单胞菌（Pseudomonas sp.）W7产低温蛋白酶的因素进行显著性分析，筛选出对产酶影响显著的3 个因素：葡萄糖、蛋白胨和MgSO4；然后用最陡爬坡试验逼近最大产酶区域；应用Box-Behnken原理设计和响应面分析确定产酶培养基的最佳组合为：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L，低温蛋白酶的酶活力达到了183.9 U/mL，比优化前提高了21%。另外，对Pseudomonas sp. W7的产酶条件进行了优化，在单因素的基础上，利用正交试验设计，最终确定产酶的最优培养条件为：培养温度为20 ℃、初始pH值为7.0、接种量为3%、装液量为20%、摇床转速为100 r/min，在最佳条件时测得的酶活力为193.2 U/mL。通过生长曲线和产酶曲线的测定，确定产酶的培养时间为48 h。

低温蛋白酶；假单胞菌W7；培养条件优化；响应面分析

低温微生物及其所产的极端酶类已成为国际研究的一个热门领域[1-2]。低温蛋白酶是低温微生物分泌的催化肽键水解的一类酶，它的最适温度一般在40 ℃以下，在低温条件甚至0 ℃时都有一定的催化效率[3]。低温蛋白酶大都是由低温环境中的微生物在低温胁迫的情况下为了适应极端环境而产生的，例如两极地区、冰窟、高山、深海和冻土等天然的低温环境以及冰箱、冷库等人为低温环境中的微生物[4-5]。此外，也可从低温植物和冷血动物上分离到[6]。目前，研究比较深入的低温蛋白酶大多数是从低温微生物和适冷鱼类体内分离出来的，其中低温微生物主要包括：真菌、细菌和酵母等。产低温蛋白酶的细菌主要属于Pseudomonas属、Xanthomonas属、Aeromonas属和Colwellia属等[7-8]。近年来，随着全基因组学和蛋白质组学的应用以及各种低温酶晶体结构[9]的获得，为进一步探究极端环境微生物适应机制和低温酶的分子结构奠定基础[10]。低温微生物在温度比较低的环境中长期进化适应，拥有了能够在低温条件下生存繁殖的结构特征和生理生化机制，相应地，由其产生的低温蛋白酶也具有特殊的结构和生理特性[11]，在食品[12-13]、化妆品[14-15]、洗涤[16-18]、污水处理等工业上有着中温蛋白酶无法比拟的优越性，在很多领域都有广泛的应用潜力。

培养基的组成对低温菌分泌蛋白酶影响比较明显，尤其是碳源、氮源，研究快速利用碳源的阻遏作用和适合长度多肽的诱导作用最为重要[19-20]。本研究是在前期单因素优化的基础上，利用响应面法优化产酶培养基，并利用SAS软件对试验数据进行分析，从而确定产酶培养基的最佳组成。另外，本研究在确定最佳培养基的基础上，采用正交试验设计从培养温度、培养基的初始pH值、接种量及装液量等几个方面对产酶条件进行了优化，以期获得最佳培养条件，为后续科学研究和工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

假单胞菌（Pseudomonas sp.）W7，由黑龙江大学生物工程专业实验室保藏。

1.1.2 培养基

基础培养基：葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、酵母膏2 g、K2HPO45 g、KH2PO42 g、MgSO40.1 g、CaCl20.2 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2，115 ℃高压灭菌30 min。

1.1.3 试剂

牛肉膏、蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖 天津科密欧化学试剂有限公司；干酪素 郑州皇朝化工产品有限公司。

1.2 仪器与设备

TU1810紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；SPX-250B型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；MLS-3020灭菌锅 日本三洋公司；HZQ-F160振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；低温高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力的测定

蛋白酶活性采用Folin-酚法测定[21]。用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）配制的2 g/100 mL酪蛋白为底物。用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）将酶液稀释合适的倍数。取1 mL稀释的酶液，在35 ℃条件下保温1 min，加入同样温度的底物1 mL，在35 ℃条件下反应10 min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸终止反应。在35 ℃保温20 min后，12 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸钠，混匀后加入1 mL的福林试剂，混匀后在35 ℃保温20 min，然后用分光光度计测定660 nm波长处的光密度（OD）值。以灭活的酶样品为对照。标准曲线用不同浓度的酪氨酸来制定。酶活力单位（U）定义为在35 ℃条件下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1 个蛋白酶活力单位。

1.3.2 培养基优化

以下培养基优化试验中，培养条件为培养温度20 ℃、接种量2%、装液量28%、摇床转速为120 r/min。

1.3.2.1 Plackett-Burman试验[22]确定主要影响因素

对培养基每种成分选高低2个水平，其中高水平是低水平的1.5倍，以酶活力作为响应值，从中筛选出对产酶影响显著的培养基组分。试验设计的因素及水平如表1所示，每组试验有3个重复，取3组试验的平均值。分别计算各因素效应，并进行重要性评价。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平设计Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.2.2 最陡爬坡法确定主要影响因素的水平

最陡爬坡法[23]以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化的步长，以酶活力为响应值，从而找出各因素最大响应区域。

1.3.2.3 响应面法优化培养基最佳配比

根据Box-Behnken设计原理，采用三因素三水平的三元二次响应面分析方法[24]，优化产酶培养基。根据最陡爬坡试验的结果，自变量的试验水平分别以－1、0、1进行编码，共设计15 个试验点，其中1～12为析因点；自变量取值在各因素所构成的三维顶点；13～15是零点，为区域的中心点，中心试验重复3 次来估计试验误差。

1.3.3 产酶条件优化

以下产酶条件优化使用的培养基为优化好的产酶培养基，除考察的特定条件变化外，其他培养条件为：培养培养基pH 7.2、培养温度20 ℃、接种量2%、装液量28%、摇床转速为120 r/min。

1.3.3.1 培养温度的优化

将Pseudomonas sp. W7接种到优化好的产酶培养基上，分别在10、15、20、25、30 ℃培养48 h，测定酶活力，确定最佳培养温度。

1.3.3.2 培养基初始pH值的优化

将培养基的初始pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0这6 个梯度，培养48 h，测定酶活力，从而确定Pseudomonas sp. W7产酶培养基的初始pH值。

1.3.3.3 接种量的优化

将Pseudomonas sp. W7分别按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的接种量，接种到优化后的培养基中，培养48 h，测定酶活力，从而确定最佳接种量。

1.3.3.4 装液量的优化

采用250 mL的三角瓶，固定转速，通过改变装液量来确定最佳溶解氧。试验设置装液量分别为12%、20%、28%、40%，摇床转速为100 r/min进行发酵培养48 h，测定酶活力，从而确定最佳装液量。

1.3.3.5 摇床转速的优化

将接种后的培养基分别在80、100、120、140、160 r/min培养48 h，测定酶活力，确定最佳摇床转速。

1.3.3.6 Pseudomonas sp. W7产酶的培养条件正交试验优化

根据单因素试验结果选择培养基的初始pH值、培养温度、接种量和装液量4 个因素，进行四因素三水平的正交试验设计，确定最佳培养条件。根据在最佳产酶培养基基础上优化的最佳培养条件，进行实验验证。

将Pseudomonas sp. W7在最佳培养条件下培养，然后每隔2 h取样，在418 nm波长处测定菌体的OD值，并测定培养不同培养时间的酶活力，从而确定最佳产酶时间。

2 结果与分析

2.1 培养基优化结果与分析

2.1.1 Plackett-Burman试验及其结果分析

Plackett-Burman试验设计方案及结果如表2所示。分别计算各因素效应，并进行重要性评价。利用SAS软件对Plackett-Burman试验设计的结果进行分析，得到回归模型方差分析（表3）和各因素的主效应（表4）。从中可以发现可信度大于95%的几个因素均为培养基组分。它们对产酶影响顺序为：葡萄糖质量浓度＞蛋白胨质量浓度＞MgSO4质量浓度。本试验所得的拟合回归方程达到显著性（模型的P=0.035 15＜0.05），R2=99.98%，表明本试验99.98%的数据变异可以用此回归方程来解释。所得回归方程为：Y=163.050 0+5.4000A+3.316 7B+ 0.683 3C+0.350 0D+1.183 3E+1.183 3F+ 1.033 3G－3.366 7H－1.966 7I+2.616 7J。因此，对葡萄糖、蛋白胨和MgSO4质量浓度3 个培养基组分进行进一步优化组合。

表2 Plackett-Burman试验设计及响应值Table 2 Plackett-Burman design with experimental and predicted values of protease activity

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model from Plackett-Burman design

表4 各因素的主效应Table 4 Major effect of each factor

2.1.2 最陡爬坡试验结果

从各因素的主效应表中可以看出在影响酶活力的各主要因素中，葡萄糖、蛋白胨和MgSO4质量浓度都呈显著正效应。根据这3 个因素效应大小的比例设定它们的变化方向和步长，其他各因素分别取各自的水平进行试验。

表5 最陡爬坡试验设计与结果Table 5 Steepest ascent design with experimental values of protease activity

由表5可知，随着葡萄糖、蛋白胨和MgSO4的质量浓度3 个主要影响因素的不同变化，酶活力的变化趋势是先升后降，其中第3组培养基对应的酶活力达到了最大值，达到176.5 U/mL，相应变量接近最大响应区域，所以选取第3组条件即葡萄糖4.0 g/L、蛋白胨7.0 g/L和MgSO40.14 g/L为中心点进行响应面的分析。

2.1.3 响应面分析结果

通过规范岗位大练兵工作，能够从根本上规范队员训练行为，消防训练安全隐患，更为队员实战灭火提供扎实的业务技能基础，对保障队员灭火安全、提升队员救援能力起到了积极的推进作用。下一步，治安保卫处将结合公司应急救援队伍建设要求，完善岗位标准作业流程大练兵内容，为提升集团公司应急救援能力不断前行。

根据最陡爬坡试验的结果，设计Box-Behnken试验的因素与水平，设计方案及结果见表6。

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Box-Behnken design with experimental and predicted values of protease activity

通过SAS的响应面回归过程进行数据分析，建立二次响应面回归模型，并进而寻求最优响应因子水平。回归方程中回归系数的估算值见表7，得到拟合二次回归方程：Y=－1 955.600 0+314.283 3A+286.608 3B+ 6 624.792 0C－36.266 7A2+0.900 0AB－112.500 0AC－20.366 7B2－30.000 0BC－20 979.170 0C2。

表7 回归方程中回归系数的估计Table 7 Estimated coeffi cients of regression equation from Box-Behnken design

表8 模型方程方差分析Table 8 Analysis of variance of model equation from Box-Behnken design

表7、8的数据分析表明二次响应面回归模型显著（决定系数R2=0.974 2），模型拟合程度很好，说明这3 个因素及其二次项能解释酶活力变化的97.42%；模型回归P=0.001 9；拟合不足P=0.620 4，说明模型失拟不显著，方程回归显著，所以该模型可以用于产酶培养基优化的理论预测。回归方程中线性项和二次项也是显著的（P值分别为0.001 5和0.799 0），交叉项不显著，说明响应面分析的3 个因素之间的交互效应较小。任意两个因素与酶活力之间的关系可通过三维与二维图形立体直观地表现出来（图1～3）。

在获得回归非线性模型和响应面之后，对已回归的非线性模型方程求一阶偏导，并令其等于零得到三元一次方程组，可以得到曲面的最大点，求解此方程组得到最大产酶水平的最佳培养基组分质量浓度，即葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、MgSO40.14 g/L，酶活力预测值为180.2 U/mL，也即产酶水平最高时培养基最优组成：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L。

以该法选出的最适培养基组分质量浓度进行发酵实验，发酵产酶水平达到183.9 U/mL，实验值与模型计算值相差2.05%，可见该模型可以较好地预测实际发酵情况。证明了响应面分析法优化Pseudomonas sp. W7产酶发酵培养基是可行有效的。经优化后Pseudomonas sp. W7产低温蛋白酶的能力由151.8 U/mL提高到183.9 U/mL，提高了21%。

图1 培养基中葡萄糖和蛋白胨质量浓度对蛋白酶活力影响的响应面及等高线图Fig.1 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of glucose and peptone concentration on the production of the protease

图2 培养基中葡萄糖和MgSO4质量浓度对蛋白酶活力影响的响应面及等高线图Fig.2 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of glucose and MgSO4concentration on the production of the protease

图3 培养基中MgSO4和蛋白胨质量浓度对蛋白酶活力影响的响应面及等高线图Fig.3 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of MgSO4and peptone concentration on the production of the protease

2.2 产酶条件优化结果与分析

2.2.1 培养温度对产酶的影响

图4 培养温度对Pseudomonas sp. W7产酶的影响Fig.4 Effect of culture temperature on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

如图4所示，从10 ℃开始随着培养温度的升高酶活力逐渐增大，在20 ℃时酶活力达到最大值，而后随着培养温度的升高，酶活力逐渐下降，到30 ℃时，酶活力仅为最大酶活力的15%。可见培养温度对Pseudomonas sp. W7的分泌蛋白酶的影响比较显著。低温能够诱导能够提高酶的表达量，而且温度有时也影响耐冷菌分泌低温蛋白酶的种类[25]。因此，Pseudomonas sp. W7产酶的最佳培养温度为20 ℃。

2.2.2 培养基初始pH值对Pseudomonas sp. W7产酶的影响

试验分别控制发酵培养基初始pH值在5～10之间进行培养，在不同pH值条件下所测得的酶活力表明：pH值对微生物的生长代谢有重要影响，当处于最适pH值时，菌体的产酶速率最快，故其酶活力也最大。由图5可知，当培养基初始pH值在7.0时，酶活力可达最大，所以Pseudomonas sp. W7产酶的最佳pH值为7.0。

图5 培养基的初始pHH 值对Pseudomonas sp. W7产酶的影响Fig.5 Effect of initial medium pH on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.3 接种量对Pseudomonas sp. W7产酶的影响

分别以0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的不同接种量作对比进行试验，结果见图6，当接种量为2%时，酶活力可达到最大值，所以最适接种量为2%。

图6 接种量对Pseudomonas sp. W7产酶的影响Fig.6 Effect of inoculum amount on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.4 装液量对Pseudomonas sp. W7产酶的影响

试验设计装液量分别为12%、20%、28%、40%，摇床转速为100 r/min进行发酵，结果如图7所示，当250 mL三角瓶的装液量为50 mL时，测得的酶活力最高，所以最适装液量为20%。

图7 装液量对Pseudomonas sp. W7产酶的影响Fig.7 Effect of medium loading volume on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.5 摇床转速对Pseudomonas sp. W7产酶的影响

图8 摇床转速对Pseudomonas sp. W7产酶的影响Fig.8 Effect of rotation speed on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

采用250mL的三角瓶，在其他培养条件一定的情况下，改变摇床转速来检测摇床转速对产酶的影响，结果如图8所示，当摇床转速为100 r/min时产酶达到最大值，随着摇床转速的增大，产酶没有明显的变化，摇床转速对产酶的影响不大。因此，确定最佳的摇床转速为100r/min。

2.2.6 产酶条件正交试验优化结果

通过对Pseudomonas sp. W7产酶培养条件的单因素试验结果，选取对酶活力影响较大的4 个因素，即培养基的初始pH值、培养温度、接种量和装液量进行四因素三水平正交试验。

表9 产酶条件的正交试验设计及分析Table 9 Orthogonal array design with experimental values of protease activity

表10 产酶条件的正交试验结果方差分析Table 10 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

由表10可知，从方差分析结果（F比）可以看出，培养条件对产酶的影响的显著性次序为：培养基的初始pH值＞培养温度＞接种量＞装液量。根据正交试验结果（表9）中k值表明：Pseudomonas sp. W7产低温蛋白酶最佳的条件为培养基的初始pH7.0、培养温度20℃、接种量3%、装液量20%。根据上述优化的最佳培养基及培养条件进行实验验证，实际测得的酶活力为193.2 U/mL。

2.2.7 Pseudomonas sp. W7的生长曲线和产酶曲线

图9 Pseudomonasmonas sp. W7的生长曲线与产酶曲线Fig.9 Growth and protease production curves of Pseudomonas sp. W7

在最佳产酶培养条件下测定并绘制了Pseudomonas sp. W7的生长曲线和产酶曲线。由图9可知，Pseudomonas sp. W7在6 h左右进入对数期，22 h后进入稳定期。低温蛋白酶的产生与菌体生长呈现正相关。菌体生长进入对数期后即分泌低温蛋白酶，酶活力不断上升，在48 h时达到最高，后略有波动。

3 结 论

采用响应面优化法快速筛选影响Pseudomonas sp. W7菌株产低温蛋白酶培养基中的显著因素，并通过建立多项数学模型，采用统计分析对模型进行显著性检验来优化产酶培养基的最佳组成。优化得到的最佳产酶培养基为：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L。优化后，Pseudomonas sp. W7的产酶能力达到183.9 U/mL，比优化前提高了21%。在单因素的基础上利用正交试验设计对产酶的培养条件进行优化，最终确定产酶的培养条件为：培养温度为20 ℃、培养基的初始pH值为7.0、接种量为3%、装液量为20%、摇床转速为100 r/min。在最佳条件时测得的酶活力为193.2 U/mL。通过生长曲线和产酶曲线的测定，确定产酶的培养时间为48 h。

对低温酶的研究无论在基础资源发掘方面，还是在产业应用方面都具有重要意义。本研究对Pseudomonas sp. W7产低温蛋白酶培养基及产酶条件进行了优化，为Pseudomonas sp. W7进一步的工业化生产、耐冷菌以及低温蛋白酶的深入研究奠定了基础。

[1] MARGESIN R, MITEVA V. Diversity and ecology of psychrophilic microorganisms[J]. Research in Microbiology, 2011, 162(3): 346-361.

[2] 吕明生, 吕凤霞, 房耀维, 等. 低温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究[J]. 食品科学, 2007, 28(12): 235-239.

[3] 陈秀兰, 张玉忠. 适冷酶结构与功能的关系[J]. 中国农业科技导报, 2007, 9(3): 57-60.

[4] CAVICCHIOLI R, SIDDIQUI K, ANDREWS D, et al. Lowtemperature extremophiles and their applications[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13(3): 253-261.

[5] 朱巍巍, 李杨, 朱万琴, 等. Enterococcus faecalis RQ15产低温中性蛋白酶的纯化及酶学性质[J]. 食品科学, 2011, 32(11): 239-242.

[6] RUSSELL N. Molecular adaptations in psychrophilic bacteria: potential for biotechnological applications[J]. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1998, 61: 1-21.

[7] MARGESIN R, PALMA N, KNAUSEDER F, et al. Proteases of psychrotrophic bacteria isolated from glaciers[J]. Journal of Basic Microbiology, 1991, 31(5): 377-383.

[8] 吕明生, 王淑军, 李华钟. 海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407产低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究[J]. 食品科学, 2010, 31(21): 298-303.

[9] PAPALEO E, RICCARDI L, VILLA C, et al. Flexibility and enzymatic cold-adaptation: a comparative molecular dynamics investigation of the elastase family[J]. Biophysica Acta, 2006, 1764(8): 1397-1406.

[10] METHE A, NELSON K, DEMING J, et al. The psychrophilic lifestyle as revealed by the genome sequence of Colwellia psychrerythraea 34H through genomic and proteomic analyses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005, 102(31): 10913-10918.

[11] 祁丹丹. 产低温蛋白酶菌株的选育、产酶条件的优化及酶学性质研究[D]. 无锡: 江南大学, 2013.

[12] GUO Zhongpeng, QIU Chongyan, ZHANG Liang, et al. Expression of aspartic protease from Neurospora crassa in industrial ethanolproducing yeast and its application in ethanol production[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 48(2): 148-154.

[13] 陈飞, 吴生文, 张志刚. 蛋白酶在酒类生产中的应用现状[J]. 酿酒, 2010, 37(6): 9-11.

[14] 陈秀兰, 张玉忠, 高培基, 等. 渤海湾浅表海水中产低温蛋白酶适冷菌的筛选[J]. 海洋科学, 2000, 24(9): 42-45.

[15] SUNDARARAJAN S, KANNAN C N, CHITTIBABU S. Alkaline protease from Bacillus cereus VITSN04: potential application as a dehairing agent[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2011, 111(2): 128-131.

[16] ROOVERS M, SANCHEZ R, LEGRAIN C, et al. Experimental evolution of enzyme temperature activity profi le: selection in vivo and characterization of low-temperature-adapted mutants of Pyrococcus furiosus omithine carbamoyltransferase[J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(3): 1101-1105.

[17] VENUGOPAL M, SARAMMA A V. Characterization of alkaline protease from Vibrio fl uvialis strain VM10 isolated from a mangrove sediment sample and its application as a laundry detergent additive[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(6): 1239-1243.

[18] RAI S K, MUKHERJEE A K. Statistical optimization of production, purification and industrial application of a laundry detergent and organic solvent-stable subtilisin-like serine protease (Alzwiprase) from Bacillus subtilis DM-04[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010, 48(2): 173-180.

[19] 肖怀秋, 林亲录, 李玉珍, 等. 微生物碱性蛋白酶研究进展[J]. 中国食品添加剂, 2005(5): 60-64.

[20] MARGESIN R, DIEPLINGER H, HOFMANN J, et al. A cold-active extracellular metalloprotease from Pedobacter cryoconitis: production and properties[J]. Research in Microbiology, 2005, 156(4): 499-505.

[21] 上海市酿造科学研究所. SB/T 10317-1999 蛋白酶活力测定法[S].中国: 行业标准-商业, 1999.

[22] 张桢, 杨贤庆, 马海霞. Plackett-Burman法和中心组合法优化罗非鱼下脚料酶解工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(18): 1-5.

[23] 顾艳丽, 张慧, 刘赛男, 等. 响应面优化产碱性蛋白酶菌株的产酶条件优化[J]. 大连工业大学学报, 2011, 30(1): 5-9.

[24] 李旺军, 方华, 谢广发, 等. RSM法优化Aspergillus oryzae AO-01产糖化酶条件的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(11): 322-326.

[25] 王全福. 南极嗜冷菌Colwellia sp. NJ341产适冷蛋白酶及低温适应性的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2006.

Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Cold-Adapted Protease Produced by Pseudomonas sp. W7

KANG Chuanhong1, TIAN Yaxin2, LI Xiuliang2, DONG Yijie2, YUAN Jihong1, WANG Yunlai2, HAN Xiaoyun2,*
(1. School of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. School of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Cold-adapted proteases have great superiority in the food, cosmetic, pharmaceutical and detergent industries due to high catalytic activity at low temperature and thermal instability. In the present study, the Plackett-Burman design was used to identify glucose, peptone and MgSO4as the most signifi cant medium components affecting the production of cold-adapted protease by Pseudomonas sp. W7. Then the steepest ascent experiment was used to approach the optimal region of the three medium components. Box-Behnken design and response surface analysis were used to determine the best culture medium containing 4.25 g/L glucose, 7.00 g/L peptone, 4.00 g/L casein, 5.00 g/L K2HPO4, 1.00 g/L KH2PO4, 0.26 g/L CaCl2and 0.14 g/L MgSO4. After the optimization, the yield of the protease was increased by 21% to 183.9 U/mL. In addition, the optimal culture conditions for producing cold-adapted protease using the optimized medium were determined using combination of single factor experiments and orthogonal array design experiments as culture temperature of 20 ℃, initial medium pH of 7.0, inoculum amount of 3%, medium loading volume of 20% and rotation speed of 100 r/min. Under these conditions, the enzyme activity w as 193.2 U/mL. Based on the growth curve and enzyme production curve, the optimal culture period was determined to be 48 h.

cold-adapted protease; Pseudomonas sp. W7; optimization of fermentation conditions; response surface analysis

Q814.9

A

1002-6630（2015）19-0163-07

10.7506/spkx1002-6630-201519029

2014-10-29

黑龙江省自然科学基金项目（C201035）

康传红（1966-），女，教授，博士，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：kangchh@163.com

*通信作者：韩晓云（1970-），女，副教授，博士，研究方向为生物工程。E-mail：zbjnefu@126.com