三七三醇皂苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白表达的影响

三七三醇皂苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白表达的影响

张利军白宇侯育青程记伟陈黎佶

(上海中医药大学附属普陀医院神经内科,上海200062)

摘要〔〕目的了解局灶性脑缺血再灌注后梗死区周围微管相关蛋白(MPA)2、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的动态变化以及三七三醇皂苷对其表达的影响。方法采用改良的线栓法制备大脑中动脉阻塞0.45 h后，不同再灌注时间(1、7、14、21、28 d) ，大鼠短暂局灶性脑缺血模型。应用免疫双标法观察再灌注损伤后1、7、14、21、28 d Brdu、Brdu/MPA2 、Brdu/GFAP表达及三七三醇皂苷对其影响。结果脑缺血再灌注后14 d Brdu表达水平达到峰值,至再灌注28 d Brdu表达水平已明显回落,但仍较正常水平高。再灌注7、14、21 d,三七三醇皂苷组Brdu/GFAP阳性细胞比例高于模型组(P<0.05)。三七三醇皂苷组Brdu/MPA2阳性细胞水平于整个实验过程中均较相同时间段对照组增多，但都无显著差异(P>0.05) 。结论脑缺血再灌注后神经干细胞增殖水平增高，而三七三醇皂苷治疗可能加速了神经干细胞的增殖，并可能使增殖的神经干细胞更多向胶质细胞分化。

关键词〔〕三七三醇皂苷; 脑缺血再灌注; Brdu;微管相关蛋白(MPA)2;胶质纤维酸性蛋白(GFAP)

中图分类号〔〕R743.3〔

基金项目：上海市教委基金资助项目(No.08CZ039)

第一作者：张利军(1971-)，男，硕士，硕士生导师，副主任医师，主要从事脑血管疾病研究。

三七三醇皂苷(PTS) 主要活性成分人参三醇皂苷Rg1 的含量达60%以上,Rg1、R1、Re 三者的含量约达80%。在研究三七中人参三醇皂苷对脑缺血的保护作用时发现PTS可通过抑制脑血管通透性的增加，减轻脑水肿，使得神经细胞、神经胶质细胞、小血管及毛细血管周围间隙轻度增宽，神经细胞肿胀明显减轻，有利于神经细胞的修复〔1〕。本实验观察不同时期梗死区周围皮层5-溴脱氧尿嘧(Brdu)、Brdu/微管相关蛋白(MPA)2、Brdu/胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况，识别缺血再灌注损伤后增殖细胞的来源和分化情况及PTS对其的影响。

1材料与方法

1.1动物模型制备及分组健康雄性SD 大鼠,体重250～300 g ,由安徽医科大学实验动物中心提供。7%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用改良Longa线栓法阻塞大鼠大脑中动脉，建立急性局部脑缺血模型。45 min后，将尼龙线轻柔拉回致颈外动脉处，即为再灌注开始。将尼龙线仅留在颈内动脉而不入颅，45 min后，将尼龙线拉回致颈外动脉处，为假手术组。动物随机分为:①PTS (成都华神集团股份有限公司制药厂)组(PTS 50 mg·kg-1·d-1);②模型组(0.9%氯化钠1 mg·kg-1·d-1)③假手术组。每组又分造模后第1、7、14、21、28天共5个时间组,其中PTS组、模型组每个时间组各5 只,假手术组各4只。

1.2PTS及Brdu给药PTS 组大鼠于再灌注术后按50 mg/kg 腹腔注射给药,每天1次,直至取材;模型组大鼠,药物由生理盐水代替; 各组大鼠达规定时限前1 d,腹腔注射Brdu(50 mg/kg,Sigma公司)2次,间隔3 h ,最后1 次注射后24 h 大鼠在麻醉下,断头取脑。

1.3免疫双标染色严格按照操作步骤固定、取材、切片、封片，-20℃保存待共聚焦观察各组皮层Brdu、Brdu+MPA2、Brdu+GFAP阳性表达。

1.4图像分析切片在统一放大倍数(10×10) 下,于梗死区周围皮层随机选3个视野,测量方式选全视场测量,使用上海求为生物科技有限公司MIQAS医学图像免疫组化定量分析软件自动分析检测出荧光图像中阳性区域面积和阳性比率。

1.5统计学方法采用PEMS软件进行方差分析,两两比较用SNK-q检验。

2结果

2.1脑缺血再灌注后梗死区周围皮层Brdu阳性细胞比较假手术组Brdu 阳性标记物为圆形、卵圆形或椭圆形、呈亮蓝色、境界清晰，主要分布在室管膜、室管膜下区及海马齿状回且数目少、分散。PTS组及模型组缺血再灌注1 d,Brdu阳性细胞开始增多,于缺血中心区及缺血周边皮层、海马呈散落分布，PTS组与模型组间无明显差异(P>0.05)。PTS组与模型组缺血周边皮层于再灌注7、14 d,均可见Brdu阳性细胞数目急剧增多并达高峰,至21 d时增长幅度下降,尤以模型组明显。在缺血再灌注第7、14、21、28天时,PTS组与模型组间Brdu阳性细胞数有显著差异(P<0.05)。见表1。

表1　脑缺血再灌注后梗死区周围皮层Brdu阳性细胞变化

与模型组比较：1)P<0.05；下表同

2.2免疫双标染色观察GFAP、MPA2表达免疫双标染色: 整个实验过程中假手术组仅有少量Brdu/GFAP阳性标记细胞，模型组和PTS 组梗死区周围皮层可见较多Brdu/GFAP阳性标记细胞分布,Brdu/GFAP阳性为蓝色加红色荧光(图1)。再灌注1 d时模型组和PTS组即可见梗死区周围皮层Brdu/GFAP阳性细胞,明显多于假手术组(P<0.05)，但模型组和PTS组相比无明显差异(P>0.05)。再灌注7 d时,Brdu/GFAP阳性细胞明显增多,再灌注14 d时Brdu/GFAP阳性细胞数目达顶峰(图1),围绕梗死区皮层散在分布，且模型组和PTS 组相比Brdu/GFAP阳性细胞差异有统计学意义(P<0.05)。此后，随Brdu阳性细胞数目逐渐回落,Brdu/GFAP阳性细胞数目亦有所减少,至再灌注28 d时,Brdu/GFAP阳性细胞数已明显回落。 在整个实验过程中，尽管PTS组在缺血再灌注第1、7、14、21、28天各时间点Brdu/MPA2阳性细胞数均比模型组多，且有随再灌注时间延长逐渐增趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图1　PTS组及模型组再灌注14 d梗死区周围Brdu/GFAP 阳性表达(免疫双标法，×100)

组别nBrdu/GFAP1d7d14d21d28dBrdu/MPA21d7d14d21d28dPTS组52.2465.8488.221)7.491)3.9982.1982.8083.7563.3183.192模型组52.0524.6126.4065.773.3221.7442.312.9442.6542.742假手术组40.82751.051.06750.8650.86251.00511.2551.00251.0475

3讨论

脑缺血损伤时损伤侧的海马、室管膜、大脑皮质和健侧海马区域的神经干细胞(NSC)增殖、迁移和分化为神经元和星形胶质细胞，以试图代偿和修复损伤的神经组织〔2,3〕。Brdu阳性细胞可被看作具有增殖活性的细胞〔4〕。但由于脑梗死所致的血脑屏障破坏及动物模型制作过程中的手术损伤刺激均可以引起脑内炎性细胞增殖,因此脑梗死后增殖的细胞既有炎性细胞也有神经前体细胞。NSC具有自我复制和多向分化(神经元、胶质细胞)的潜能〔5〕，MPA2在成熟的神经元中有较高的表达水平，近年来被认为是神经元身份鉴定的特异性抗原之一。 GFAP是星形胶质细胞特异性抗原标志。因此应用Brdu/MPA2、Brdu/GFAP 免疫双标记法可确定增殖细胞的来源及神经干/前体细胞的数目和分布情况。

研究显示，PTS可减少缺血再灌注大鼠脑组织Nogo-A mRNA和蛋白表达、减少Caspase-3表达、抑制脑缺血再灌注后炎症因子分泌及细胞凋亡，从而起到脑保护作用〔6～8〕。已有研究显示反应性星形胶质细胞增生与维持脑损伤后内环境的稳定、促进血管再生、神经生长、有利于可塑性修复作用发生〔9〕,同时,活性星形胶质细胞释放神经营养因子,是促进神经细胞再生的最有效的因子,作为神经细胞生长调节信号可以调节神经细胞构筑、存活及可塑性变化,诱导合成增加,提供轴索合成基质,参与内源性修复,以促进中枢神经和周围神经轴索的生长和存活,在神经细胞再生过程中起相当重要的作用。室管膜下区的NSC正常情况下是相对静止的,诱导或刺激其发生增殖、分化的因素中,基础成纤维细胞的作用尤为令人注目,基础成纤维细胞作为刺激NSC 增殖的重要的丝裂原,可以诱导相对静止的神经干细胞进入细胞周期，若将基础成纤维细胞注入成年鼠的侧脑室内,则可促进NSC增殖及新生细胞数量的增加〔10,11〕。本研究推测脑缺血再灌注后神经元再生比较困难，而PTS治疗可能加速了NSC的增殖，并可能使增值的NSC更多向胶质细胞分化，其机制有待进一步研究。另外在缺血中心区亦有散在分布的增殖细胞,但此类细胞并无Brdu/MPA2、Brdu/GFAP阳性标记,推测可能是侵入的炎性细胞。

4参考文献

1向秋玲，陈健文，马仁强，等.三七中人参三醇皂苷对脑缺血的保护作用〔J〕.中山大学学报，2008;29(6)：705-9.

2Yagita Y,Kitagawa K,Ohtsuki T,etal.Neurogenesis by progenitor cells in the ischemic adult rat hippocampus〔J〕.Stroke,2001;32(8):1890-6.

3Zhang RL,Zhang ZG,Zhang L,etal.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia〔J〕.Neuroscience,2001;105(1):33-41.

4Ngwenya LB,Rosene DL,Peters A. An ultrastructural characterization of the newly generated cells in the adult monkey dentate gyrus〔J〕.Hippocampus，2008；18(2):210-20.

5Ma DK,Bonaguidi MA,Ming GL,etal.Adult neural stem cells in the mammalian central nervous system〔J〕.Cell Res，2009;19(6): 672-82.

6张利军，白宇，侯郁青,等.三七三醇皂苷对局灶脑缺血再灌注大鼠不同复时期脑组织Nogo-A mRNA和蛋白表达的影响〔J〕.上海中医药大学学报,2010;24(1)：59-62.

7张利军,白宇,侯郁青,等.三七三醇皂苷对局灶脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积及caspase-3表达的影响〔J〕.中医药导报,2007;13(9)：68-70.

8刘宗超,周官恩,赵克建,等.三七三醇皂苷对大鼠脑缺血再灌注脑损伤保护作用的实验研究〔J〕.中风与神经疾病杂志,2007;24(2)：38-40.

9Frank W. Pfrieger roles of glial cells in synapse development〔J〕.Cell Mol Life Sci，2009;66(13): 2037-47.

10Gage FH. Mammalian neural stem cells〔J〕.Science,2000;287(5457):1433-8. Mammalian neural stem cells〔J〕.Science,2000;287(5457):1433-8.

11Ilaria Decimo,Francesco Bifari,Mauro Krampera,etal.Neural stem cell niches in health and diseases〔J〕.Curr Pharm Des,2012;18(13): 1755-83.

〔2013-09-13修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)