肥达氏反应实验方法的改进

覃艳春，曾 怡，黄干荣，韦红玉，陆 钢

（1.右江民族医学院/桂西微生物感染研究重点实验室，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000）

肥达氏反应实验方法的改进

覃艳春1，曾 怡1，黄干荣1，韦红玉1，陆 钢2*

（1.右江民族医学院/桂西微生物感染研究重点实验室，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000）

目的 探讨肥达氏反应实验技术的改进方法，使学生操作起来更容易，减少试剂用量，缩短试验反应时间。方法 用移液器加样，微量孔代替试管，52℃水浴1 h。结果 微量孔法相对于试管法操作简单快速，试剂用量少，反应时间短。结论肥达氏反应实验采用的微量孔法可以代替试管法。

肥达氏反应；实验方法；微量孔法

肥达氏反应实验是医学微生物学的一个基础实验，是应用血清学方法，根据已知的伤寒杆菌的“O”“H”抗原，甲型、乙型副伤寒的“H”抗原和病人感染伤寒或副伤寒后，约经1～2周即可在血清中出现的抗体，在适当电解质参与下出现肉眼可见的凝集现象，根据凝集现象判断凝集效价，在临床上用于辅助诊断伤寒及副伤寒病。

针对肥达氏反应实验存在所用的伤寒诊断血清价格昂贵，伤寒血清制备费时、费力，反应时间长（24 h）等缺点，近年来有同行对此反应进行了改进，如丁金龙[1]的聚凝胺法，霍立新[2]的离心法加速了反应时间等。虽然如此，但他们对肥达氏反应实验的改进仍未解决上述全部问题，因此，我实验室对此实验再加以改进，用微量孔法代替传统的试管法。在学生实验中，经过几年的实际运用效果良好。改进前后方法对比介绍如下。

1改进前的实验方法——试管法[3]

1.1材料

（1）伤寒待测血清[3]1∶20稀释）。

（2）试剂伤寒沙门氏菌菌体抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原及乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原，来源于宁波天润生物药业有限公司。

1.2方法

（1）取洁净小试管24支，以4排6列摆放在试管架上，试管按顺序编号并标记抗原种类。

（2）用5 ml吸管吸取生理盐水，各管加入0.5 ml。

（3）另取1 ml吸管吸取1∶20稀释血清，分别加入每排的第1管内，每管0.5 ml，吸吹3次充分混合，将血清稀释为1∶40。

（4）依次类推血清对倍稀释至各排第5管、从第5管中吸0.5 ml弃置消毒容器。此时第2、3、4、5管血清的浓度分别为1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

（5）第6管不加血清，作为抗原对照管。

（6）加入抗原：第1排各管加入伤寒血清“H”抗原3滴。第2排各管加入伤寒血清“O”抗原0.5 ml。第3排各管加入甲型副伤寒“A”抗原3滴。第4排各管加入乙型副伤寒“B”抗原0.5 ml。

Y2 的模型回归方程为：Y2=-228.229+43.9125x1+8.79167x2+3.32937x3-6.78333x12-0.389583x22-0.0132083x32+0.3125x1x2-0.0475x1x3-0.001875x2x3。

（7）混匀，置于37℃电热恒温水浴箱18～24 h观察结果。1.3结果

（1）观察对照管（第6管），管度有圆形沉淀物，摇动试管，液体均匀混浊。

（2）从各排第1～5管顺序观察试验管，大部分细菌被凝集于管底，液体轻度混浊为++。

（3）凝集效价的确定，以血清的最高稀释度仍能出现明显凝集（++）的，为被检血清的凝集效价。

2改进后的实验方法——微量孔法

2.1材料

（1）伤寒待测血清[3]1∶20稀释）。

（2）试剂伤寒沙门氏菌菌体抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副伤寒沙门菌鞭毛抗原及乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原，来源于宁波天润生物药业有限公司。

（3）生理盐水、U型微孔反应板、50 μl移液器（来自上海求精生化试剂仪器有限公司）、吸头、52℃电热恒温水浴箱（来自国营创新医疗器械厂，型号S648）。

2.2方法

（1）准备4排微量U型小孔，每排6孔，标明记号。

（2）每孔加入生理盐水50 μl。

（3）每排第一孔加入待测血清50 μl，混匀，将血清稀释为1∶40。

（4）进行对倍稀释，即吸取第1孔50 μl血清放置第2孔，再从第2孔吸取血清50 μl放置第3孔，以此类推连续稀释第5孔为止，从第5孔中吸50 μl弃置消毒容器。此时第2、3、4、5孔血清的浓度分别为1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

（5）第6孔不加血清作阴性对照孔。（6）每排加入对应的伤寒菌液50 μl。（7）混匀，置于52℃电热恒温水浴箱观察结果。

2.3结果

（1）观察对照孔，无凝集反应，再观察各孔的凝集情况。

（2）上清液澄清度大约50%，约50%细菌集成块沉于孔底记++。

（3）以呈现++凝集现象的血清的最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。

3结论

同一份伤寒血清标本，改进后的微量孔法跟传统的试管法结果（效价）相同。试管法与微量孔法试剂用量和实验时间见表1。

表1 两种方法使用试剂与时间的比较

4讨论

从上述实验操作过程和结论来看，改进后的微量孔法相对传统的试管法有操作更简便、试剂用量少、实验时间短的特点。任何一门课程、学科的发展都会经历不断探索、不断完善的过程[4]，任何实验技术也要精益求精，在此思想指引下我们对该实验技术进行了改进。肥达氏反应实验是我校各专业本科学生医学微生物学实验内容之一，每学年要做这个实验的学生达1 200人，在试剂用量上，按照两个学生一组来计算，肥达氏反应用微量孔法代替试管法可以节省270 000 μl伤寒血清试剂，“O”、“H”、甲型、乙型伤寒诊断血清各节省了1 350 000 μl，在节约教学经费的同时，也更加低碳环保。在操作上，微量孔法用的是移液器加样相对试管法用吸管加样对学生来说操作更简单，也更准确。在实验时间上，52℃水浴1 h比37℃水浴24 h看结果节省了23 h。综上所述，肥达氏反应微量孔法有诸多优点，可以替代试管法推广使用。

[1]丁金龙，屠文娟.聚凝胺法在肥达反应中的应用与评价[J].江西医学检验，2006，24（4）：381.

[2]霍立新.肥达反应试验的快速法[J].检验医学与临床，2007，4（5）：431. [3]柳忠辉.医学免疫学实验技术[M].北京：人民卫生出版社，2008.

[4]吴冰，马煜峰，凌冠华，等.基础医学综合实验与实验设计课程内容改革的探索[J].基础医学教育，2013，15（7）：704-705.

（*通讯作者：陆钢）

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1671-1246（2016）23-0110-02