环境胁迫对双歧杆菌黏附能力和黏附相关蛋白的影响

朱德全, 栗金柳, 王茗悦, 孟祥晨, 许 龙, 周清波, 王长平, 薛 勇

(1. 佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)



环境胁迫对双歧杆菌黏附能力和黏附相关蛋白的影响

朱德全1,2, 栗金柳1, 王茗悦1, 孟祥晨2*, 许 龙1, 周清波1, 王长平1, 薛 勇1

(1. 佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

双歧杆菌是天然存在于人和动物肠道的微生物，对宿主发挥生物屏障、调节肠道菌群、提高免疫、抗炎和抗肿瘤等有益作用，所以经常以益生菌的形式添加到乳制品和其他食品中。双歧杆菌的黏附定植是持续发挥益生作用的前提基础。然而，双歧杆菌在生产、包装、运输、储藏和消费过程中受到许多环境胁迫因素(如热、氧、酸、胆盐和渗透压等)的影响。这些环境因素会影响双歧杆菌黏附能力和黏附相关蛋白的表达。对环境胁迫对双歧杆菌存活的影响、双歧杆菌黏附能力的影响因素和环境胁迫对黏附相关蛋白的影响等方面的研究进展进行了综述。

双歧杆菌；黏附；定植；黏附相关蛋白；环境胁迫因素

双歧杆菌是人和动物肠道最常见的革兰氏阳性有益细菌，约占人体肠道可培养微生物的10%。大量研究表明，双歧杆菌对宿主具有多种益生功能，可以通过平衡肠道菌群维持机体的整体健康水平。因此，双歧杆菌属的微生物是应用较多的益生菌之一，在食品中通常通过添加于乳制品进行食用。双歧杆菌的黏附是发挥益生功能的前提和先决条件，双歧杆菌经食用后进入体内，其益生功能的发挥与在肠道的黏附与定植密切相关，如黏附能够缩短痢疾持续时间[1]、刺激免疫应答[2-3]、竞争排斥病原微生物[4]等。因此，肠道黏附定植能力是筛选益生菌的一个重要标准[5]。双歧杆菌在生产、包装、运输、储藏和消费过程中受到许多环境胁迫因素(如热、氧、酸、胆盐和渗透压等的影响，这些环境因素会影响双歧杆菌多方面的生理特性，如微生物生长及存活、菌体表面特性、黏附能力、黏附相关蛋白的表达等。笔者对环境胁迫对双歧杆菌存活的影响、双歧杆菌黏附能力的影响因素、环境胁迫对黏附相关蛋白的影响等方面的研究进展进行了综述。

1　环境胁迫对双歧杆菌成活的影响

不同种类的双歧杆菌菌株对环境胁迫的耐受能力不同，具有种属特异性。环境胁迫条件下双歧杆菌对的存活率，存活率从高到低依次为动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌等。研究表明，两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌对模拟的胃液环境表现出非常低的耐受能力，这与Takahashi等[6]的研究结果一致。Mainville等[7]研究表明动物双歧杆菌的耐酸性显著高于长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌的耐酸性，Matto的研究也同样证实了这一结果。Saarela M等[8]以动物双歧杆菌E2010和长双歧杆菌E1884为研究对象，分别用pH 3.0和pH 4.0的磷酸盐溶液对其处理2 h，再用1.4%胆盐处理3 h，结果表明长双歧杆菌E1884经过酸处理后存活率显著下降，经过胆盐处理后，几乎不生长；进一步研究了双歧杆菌胁迫适应和细菌固有的交叉保护机制，长双歧杆菌E1884和动物双歧杆菌E2010分别经过pH 3.5预处理后其在1.4%胆盐中的存活率有所提高。Maus J E等[9]将乳双歧杆菌短时间暴露在复合胁迫环境中，发现能提高其耐酸能力。这说明不同双歧杆菌对胁迫环境的抵抗能力存在菌株差异，而且在交叉胁迫环境中，双歧杆菌的存活率升高还是降低与胁迫因素、各因素处理时间和菌株种类等都有关系。目前对双歧杆菌胁迫环境的研究主要集中于胆盐胁迫、酸胁迫、多种消化酶等单一胁迫因素的研究。

2　双歧杆菌黏附能力的影响因素

研究双歧杆菌与肠细胞的黏附通常体外采用细胞系来进行，这主要是由于人体实验实施相对困难，而且肠道环境复杂。人结肠癌细胞系(如Caco-2细胞株)，由于在体外所表现出的形态和功能特征能够模拟成熟肠道上皮细胞，经常作为体外模型用于评价益生菌的黏附和定植能力。目前，关于双歧杆菌的黏附研究较多，而对于经历胁迫后的菌体黏附相对研究较少。

2.1黏附具有种株差异性和宿主差异性不同菌株与肠道上皮细胞黏附能力各不相同，可能是不同菌株表面也存在着不同的与黏附有关的物质。因此，不同生境双歧杆菌的黏附能力存在菌株及菌种的差异性。李平兰等[10]对来自猪和人类粪便中不同种类的乳酸菌在体外与人结肠癌细胞系HT-29细胞进行黏附，结果发现在所有受试菌株中双歧杆菌的黏附能力最高，而乳杆菌的黏附能力则相对较低；其他菌属的黏附能力则介于乳杆菌属和双歧杆菌属之间，充分体现了细菌对肠道细胞黏附过程中的菌属差异性。 Del Re B等[11]对13株长双歧杆菌的黏附能力进行了测定，结果发现存在明显的菌株差异。He等[12]研究表明不同的双歧杆菌菌株对肠黏膜的黏附能力不同，从健康成年人粪便中分离的双歧杆菌对肠黏膜的黏附能力明显高于老年人，其中青春型双歧杆菌表现得尤为明显。He等[13]研究还发现双歧杆菌的黏附具有宿主特异性，从人粪便中分离出的双歧杆菌对肠黏膜的黏附能力强于其对牛肠黏膜的黏附能力。

2.2双歧杆菌黏附与菌体的“死、活”状态有关一般认为，只有活菌才具有黏附能力。Fourniat等[14]研究表明死乳杆菌也具有与活菌相同的黏附能力。伦永志等[15]对双歧杆菌菌悬液用65 ℃水浴30 min和100 ℃水浴10 min灭活处理后，发现灭活的双歧杆菌与活菌均能黏附于肠上皮细胞周围，黏附具有显著的浓度效应。Wang L Q等[5]也发现双歧杆菌的死活状态不是影响黏附能力的因素。由于死菌本身具有极高的稳定性和安全性，这就为双歧杆菌的临床应用提供了一条新途径。但是，目前这一观点尚未被广泛接受，用于临床的微生态制剂大多为活菌制剂。

2.3环境因素对双歧杆菌表面性质和黏附能力的影响双歧杆菌的黏附能力易受环境中多种因素的影响。研究表明，两歧双歧杆菌与Caco-2细胞和HT-29细胞黏附的过程中黏附能力很大程度依赖于环境变化，其中影响较大的包括pH和胆盐。双歧杆菌与人肠上皮细胞的体外黏附受pH等外界环境的影响。王彦等[16]用低pH的PBS处理两歧双歧杆菌，结果表明不同pH的PBS溶液处理后的两歧双歧杆菌的黏附能力均发生不同程度下降。2001年，Ouwehand等[17]研究发现BB12与1%和10%的胆盐共同作用后，黏附能力均显著低于未处理组。Guglielmetti S等[18]对两歧双歧杆菌MMBb75的研究表明双歧杆菌经过浓度为3%牛胆盐处理后，对Caco-2细胞的黏附能力极显著下降，这与Gmez Zavaglia A等[19]的研究结果一致。Gmez Zavaglia A等[19]分析胆盐的存在降低了双歧杆菌表面疏水性同时使菌体表面电势升高，致使双歧杆菌的黏附能力降低。Candela等[20]研究表明胆盐提高了双歧杆菌乳亚种BI07对宿主人纤溶酶原系统的相互作用，并推测消化系统中的胆盐是双歧杆菌黏附在肠道中的原因。因此，关于胆盐对双歧杆菌粘附影响的研究存在矛盾性。2009年，Guglielmetti等[18]研究发现双歧杆菌与Caco-2和HT-29细胞的黏附也取决于环境条件(如糖、胆盐和pH等)，当存在果糖和甘露糖时MIMBb75与Caco-2的黏附升高；当存在牛胆盐时，二者之间的黏附下降；此外，pH同样会显著影响细菌与Caco-2细胞的黏附以及细菌的自动聚集能力。这些研究表明双歧杆菌对肠道细胞的黏附作用是具有钙依赖性的，但钙离子浓度过大使得渗透压增大，反而会降低双歧杆菌的黏附能力，无机盐离子也会影响双歧杆菌的黏附能力。

双歧杆菌处于胁迫环境中，细胞表面物质和自动聚集能力受环境胁迫因素的影响，进而影响黏附能力。王彦等[16]用低pH的PBS处理两歧双歧杆菌，结果表明非致死pH 3.0和pH 3.5处理的双歧杆菌疏水性显著提高，自动聚集能力显著降低。1998年，Pérez等[21]用低pH处理和胰蛋白酶双歧杆菌CIDCA5310和CIDCA5317，测定其表面性质的变化，结果发现胰蛋白酶使CIDCA5310的自动聚集能力丧失，而对没有聚集能力的CIDCA5317无影响。低pH处理改变了Zeta电势，对自动聚集能力有较大影响。因此，影响自动聚集能力的可能是表面的特异性蛋白和菌体表面电荷。Canzi等[22]测定了30株双歧杆菌的表面物理化学性质，结果发现B.bifdum和B.adolescentis具有最强的自动聚集能力，且受介质pH的影响；此外，经蛋白酶处理后菌株的自动聚集能力有较大变化。因此，自动聚集能力与表面的特异性蛋白有关。Collado等[23]采用BATH测定表面疏水性和聚集能力相关性的研究发现对碳氢化合物具有越高黏附能力的细菌其自动聚集能力也较强，二者具有正相关性。双歧杆菌由于不同菌株表面物质存在的差异性，黏附素种类的差异性等导致不同双歧杆菌在相同胁迫处理下表面性质的变化也存在较大差异。

3　环境胁迫对双歧杆菌黏附蛋白的影响

由于菌体细胞表面蛋白质和分泌到细胞外的蛋白是参与黏附的关键蛋白质，胁迫又会诱导这些蛋白质表达或编码这些蛋白的基因的转录水平发生变化。Candela等[20]研究表明胆盐提高了动物双歧杆菌乳亚种BI07与宿主人纤溶酶原系统的相互作用，表明消化道的胆盐环境对该菌与宿主相互作用过程具有潜在的影响。蛋白质组学研究表明，动物双歧杆菌乳亚种[20]和长双歧杆菌[24]长时间暴露于胆盐环境会导致菌体表面的人纤溶酶原黏附受体——DnaK和烯醇化酶上调。虽然双歧杆菌表面的人纤溶晦原受体(DnaK和烯醇化酶)的上调参与了这一过程，但也不能排除其他机制的参与。Weiss等[25]对嗜酸乳杆菌NCFM应激与黏附相关基因的转录水平的研究发现，该菌在经历体外模拟消化道时编码应激相关蛋白质(GroEI、DnaK、ClpP)的基因在胃液环境中显著上调，在十二指肠液环境中显著下调；编码黏附相关蛋白质(黏蛋白结合蛋白、纤连蛋白结合蛋白、S-层蛋白)的基因在唾液和胃液环境中不受影响，而其在十二指肠液和胆盐环境中显著上调。Jin等[26]分析了长双歧杆菌BBMN68在酸适应和生长的不同阶段ffh、uvrA、groES和dnaK基因转录水平的变化，发现这些基因在生长的稳定期被显著诱导，但并不被酸胁迫诱导；酸适应120 min后，ffh和uvrA基因的下调表明长双歧杆菌的酸适应在基因表达水平上不同于其他细菌。目前，针对环境胁迫对双歧杆菌黏附蛋白的研究不是很多，大多数都是研究正常细菌对细胞的黏附。

4　小结

由于益生菌定植于人体肠道发挥益生作用前，会受到胃液的酸性环境和小肠胆盐、消化酶、渗透压等多重环境因素的影响，这些环境因素一方面对益生菌的存活造成一定的影响，另一方面通过影响菌体表面的疏水性、物理性质和自动聚集能力以及菌体表面蛋白的表达，从而改变菌体在肠道的黏附定植能力，可能会进一步影响益生菌在人体内益生作用的发挥。

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Effects of Environmental Stress on Adhesion Ability and Proteins Related to Adhesion of Bifidobacteria

ZHU De-quan1,2, LI Jin-liu1, WANG Ming-yue1, MENG Xiang-chen2*et al

(1. College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 2. Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

Bifidobacteria which are commensal microorganisms of the human and animal gastrointestinal tract (GIT) are being incorporated increasingly into dairy and other products, because of the health benefits(regulating intestinal flora, improving immunity, anti-inflammation and anti-tumor) provided by them. The adhesion and colonization abilities of bifidobacteria are critical prerequisites for performing their physiological functions. However, it must encounter a lot of stresses occurring during their production, package, delivery, storage and consumption (e.g. heat, oxygen, acid, bile, osmotic, etc). These stress factors will influence adhesion ability and expression of adhesive proteins bifidobacteria. The research advances of effects of environmental stress on bifidobacteria survival, adhesion ability and proteins related to adhesion were reviewed.

Bifidobacteria; Adhesion; Colonization; Adhesion related proteins; Environmental stress factors

佳木斯大学科研项目((S2011-049)。

朱德全(1980- )，男，贵州遵义人，讲师，博士，从事微生物生物技术研究。 *通讯作者，教授，博士生导师，从事微生物生物技术研究。

2016-06-12

S 182

A

0517-6611(2016)21-131-03