怎样做好正向间接血凝试验

王亚琴　张永勇　刘绥荣　肖港会

（①湖南省邵阳县畜牧水产局　422100　②湖南省邵阳县塘渡口镇动物防疫站）

怎样做好正向间接血凝试验

王亚琴①张永勇①刘绥荣②肖港会①

（①湖南省邵阳县畜牧水产局422100②湖南省邵阳县塘渡口镇动物防疫站）

间接血凝实验（IHA）是一种简单、快速、适用的血清学诊断技术，但实验结果受操作技术、器材、样品影响较大，本人根据多年的实践体会，现就实验中器材、试剂、样品、过程和判定标准等方面的优化做一综述，以期作为本实验的借鉴。

正向间接血凝试验因其准确度较高、操作相对简单实用、检测成本相对较低深受县级县级兽医实验室的青睐。间接血凝试验（IHA）是上世纪六十年代在我国发展起来的血清学诊断技术，是用已知血凝抗原致敏与免疫无关的惰性微粒表面（载体）检测未知血清抗体的试验，迄今仍在许多疫病诊断中广泛应用。林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法（IHA）与斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）以及猪瘟抗体免凝金标试纸条比较，对规模化养猪场138份不同阶段猪血清进行检测，三种方法检测抗体的阳性率结果接近［1］［2］。数十年来正向间接血凝试验技术不断完善，具有简单、经济、快速、实用的特点，在我国有很大的用户群，特别是规模养殖场也逐渐在使用这种诊断方法来诊断动物疫病和抗体水平，使得近年来，兰州兽医研究所生产的猪瘟和口蹄疫正向间接血凝试验的试剂用量在逐年加大；然而，该实验结果受影响因素较多。为做好正向间接血凝试验，使免疫抗体低的家畜能及时得到补免，有效地避免疫病风险。

1　试验器材的选择

本试验所使用的试验器材包括微量血凝板，微量振荡器，移液器和吸头，为保证试验的顺利进行，要选择质量有保障，稳定性好的器材，要从正规有资质的厂家或代理商处进货，。

1.1微量血凝板实验室经常使用的是有机玻璃材质1100底角的96孔V型微量血凝板，此板可以叠放，不占实验室台面，处理样品量较大时合适；如果1100底角的96孔V型微量血凝板不够或未购买，就选用90o板子做实验，清洗方法：一般先用清水浸泡，然后马上用高压清水冲洗，洗净后用手甩干板子倒置于37℃温箱中烘干。用前要先检查血凝板孔底是否干净，如发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净。除了有机玻璃板以外，还有一次性血凝板，不需清洗，也不用担心板子不干净影响结果，但不能叠放，测定少量样品适合；注意：微量血凝板在做完实验后要马上洗干净，否则时间久了再怎么洗也洗不干净的。

1.2微量振荡器使用振荡器振荡时间不宜超过10～20s钟，振荡强度不能太大，先从小到大，最后到中等强度即可；多块板叠加后振荡时要用手压住最上一板，以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性；如果实验室没有它，也可用手轻拍血凝板的边缘20秒即可；以上两种方法均已血球分布均匀为准。

1.3单、多道微量移液器建议使用高质量的移液器，如eppendorf移液器，用定量移液器需要准备50µl和25µl两种。50µl的用来加稀释液和稀释血清，25µl的用来加血凝抗原。可调的移液器要选择与检测过程中加样量相近量程的移液器，吸取液体时动作要轻缓，防止溶液吸入过快，冲入移液器污染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上把移液器恢复到最大量程的习惯；移液器要轻拿轻放，移液器如果掉到地下很容易损坏。用完后移液器用75%的酒精棉擦拭消毒。

2　试剂的选择

2.1抗原液体正向血凝抗原摇匀后呈棕红色或咖啡色，无块状物沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液的是好抗原，摇匀后仍有小块黑色沉淀物（血球团）的抗原建议不要使用，抗原放置时一定要垂直放置，使血球团处于液体中。一瓶抗原可以检测20～30份血清。值得一提的是液体正向血凝抗原4～8℃保存，保存期3个月，不能冷冻保存。

1.4吸嘴吸嘴一定要使用质量优良的国产吸嘴或进口吸嘴，决不能使用劣质吸嘴，否则会引起吸上来的液面不一样高；高质量的吸嘴经过处理后可以重复使用。处理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超声波清洗器处理10min，换水后用二层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗器处理10min，再用洗衣机甩干，高压消毒灭菌器中121℃，20min即可，去盖后任水分蒸发，或放37℃温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗干净，不必重复使用。接触过高感染性材料的吸嘴要高温消毒后废弃。经过处理后的吸嘴如果尖头变弯，则质量不好，不要重复使用。

2.2对照血清阴性对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对照血清微红或淡黄色略微粘性的液体。阴阳性对照血清应在4到8℃保存，有效期3个月。

2.3稀释液稀释液无色透明或呈淡黄色，一般情况4～8℃保存。用前建议将稀释液放37℃温箱中0.5h后摇匀再用较好。

3　样品血清的处理和优化

离心时，一般转速应设置为4000～12000转/min×3～5min之间，如果所买的离心管较差易烂则转速设低些时间设置长些；如只出点血清，则第二次重新离心（最好离心前用牙签等把已凝固的血液与离心管壁划开划松），则血清会增多，多到一定时候，再离心血清也不会增多；空间很大的离心管（如5ml真空管），静置一段时间（如一晚），一般会很好地析出血清来；多数带红色的血清静置2h左右上部会变成清亮的，仅下端有一红点，或离心后也会变成这样，但有少部分离心后照样会是带红色的血清；离心后有极少部分血清会成胶冻状，处理办法是戳碎并重新离心后速倒出血清，以免重新胶结；根据检测次数和备份的需要确定最少的血清需要量，血清有0.5～1.0ml一般够了。新分离血清应尽快检测完，未检血清-15～-20℃保存。冷冻血清待检时需融化，同时避免血清反复冻融影响检测结果，最好需经过56℃水浴灭活30min。严重溶血、严重污染、腐败、变黑或有悬浮杂质的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应，从而影响判定结果。实验过程优化

4　正向血凝试验过程

包括加稀释液、稀释待检血清、稀释阳性阴性血清、加血凝抗原、震荡静置、结果判定。在通常的试验当中，为了节约试剂和血凝板，一般横向做到第8孔就够了，现以做到第8孔为例讲讲在试验中要注意的问题：

4.1加稀释液为简便起见，先在血凝板上所有的孔上各加稀释液50µl。

4.2稀释待检血清和阴阳性血清取1号待检血清50µl加入第1排第1孔，并将枪头插入孔底，混匀后，从该孔吸取50µl移入第2孔，混匀后从该孔吸取50µl移入第3孔，直至第8孔。此时第1排1～8孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为1∶2、1∶4、1∶8、…….1∶256。每个待检血清样品均按上述方法稀释。在稀释血清操作时注意不要产生很多气泡，每稀释一份血清要换吸嘴，每次试验要做阴阳性对照各2～3排，做二排空白对照，即孔中加50µl稀释液后加25µl抗原。

4.3加血凝抗原被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25µl。血凝抗原用前要充分摇匀，瓶底应无血球沉淀。一次试验过程应选择同一批号的抗原，并先从稀释度高的孔加起，避免吸嘴和孔内的液体直接接触。

4.4振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上振荡10～20s，如发现孔中有气泡可用电吹风吹灭。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，以没有血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下静置2h或37℃下静置1～1.5h判定结果；在20℃室温下不能超过5h看，否则会不准确；也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。

5　判定标准

（1）将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1∶16孔和稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉于孔底形成边缘整齐的小圆黑点），或仅出现“+”凝集（血球大部分沉于孔底，边缘稍有少量血球凝集）。（2）阳性对照血清1∶2到1∶256各孔（1～8孔）应出现“++”到“++++”凝集为合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如图1所示，该阳性血清滴度为1∶256倍或记为8log2。（3）在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++”到“++++”凝集，6-8孔呈现“++”凝集，那么就可判定该份血清的抗体效价为1：256，或者说8log2。（4）接种口蹄疫和猪瘟疫苗的畜群免疫抗体效价达到1∶32（即5log2；第5孔）呈现“++”凝集（呈现为散开的白色云雾状）为免疫合格。不少地方作抗体筛检时样品血清只稀释8个孔，加血凝抗原时只加第3、4、5、6、7孔，只要第5孔（含）以上出现凝集的就判该血清为阳性，否则为阴性（呈现为小黑圆点状为不合格）。这种方法可以大量减少试剂的用量。值得注意的是，有时尽管小心翼翼的按标准做了，又重做了，但是，还是会出现部分比阴性对照散得开看不到小圆黑点又没阳性对照白黄的样品，笔者认为应该把这些样品也视为阳性，因为经其他试验室多次比对这些样品一般检测为阳性结果，不过，为了保险起见，建议这种检测结果最好降一格判定。

6　值得探讨的问题

不同血凝板的孵育时间和判定：试剂盒要求使用110度底角的血凝板，但不少实验室仍在使用90度底角的血凝板。如果使用的是90度底角的血凝板，结果判断时会存在一定的差异，一般结果会偏低一些。在判读结果的时间上，90度底角的血凝板判读结果在1.5～2h，低于1h会判断不准，多出现高判结果的现象。而110度底角的血凝板，判读结果时间应在2h后为妥，冬天还可适当长一点，低于1.5h会判断不准。使用90度底角的血凝板要注意掌握好判读结果的时间，也要注意样品凝集图形的梯度变化情况。如果前4个孔为100%凝集，标记为“#”或有的标记为“++++”，第5孔为成片、块状的凝集，不是均匀分布，也不是多数血球沉于孔底，这时结果可以结合第4孔为100%的情况，判终点为第5孔。如果判为第4孔则判严了。如果是110度底角的血凝板就不存在这种情况了。第4孔和第5孔的判断是这个试验的关键，判了第4孔则该份血清为阴性，判了第5孔则为阳性，阴阳之差往往就在这一下，所以要特别引起重视。

［1］ 范明远编. 于恩庶论文集［C］. 北京∶ 中华流行病学杂志编辑部，1988∶ 399-403.

［2］ 林琳， 江斌， 吴胜会等. 三种猪瘟抗体检测技术的应用比较［J］. 福建畜牧兽医， 2004，6（3）∶ 23-24.

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