氢溴酸樟柳碱预防给药对急性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用研究

陈丹丹，彭成，谢晓芳，刘莟，潘媛

·药理毒理·

氢溴酸樟柳碱预防给药对急性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用研究

陈丹丹1,2，彭成1，谢晓芳1，刘莟1，潘媛1

目的：观察氢溴酸樟柳碱预防给药对急性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用。方法：采用大鼠大脑中动脉栓塞法制备急性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，观察预防给药对缺血再灌注大鼠行为学评分、脑梗死面积、脑含水量以及血清NO、NOS、Ach、AchE的影响。结果：与模型动物比较，氢溴酸樟柳碱在预防给药小剂量下对神经行为学评分有明显改善，在脑梗死面积、脑水肿、NOS、NO方面小剂量组也都表现出改善趋势，大剂量组在脑行为学方面、脑梗死面积、NOS及Ach方面表现出改善趋势。结论：氢溴酸樟柳碱预防给药对急性脑缺血再灌注损伤大鼠有一定的保护作用。

氢溴酸樟柳碱；急性脑缺血再灌注损伤；NOS ；Ach

缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke,CIS）又称脑梗死（cerebral infarction，CI），是最常见的卒中类型，约占脑血管疾病总数的60%-80%，是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化[1]。

樟柳碱是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取出的一种生物碱，氢溴酸樟柳碱为其氢溴酸盐。查阅文献资料发现：多年来学界对其化学特性、药理作用和临床应用等方面进行了相关研究，特别是在化学特性及眼科临床应用的研究报道较多。但由于国家政策导向、及本品的特性等原因，致使对其研究呈一定的历史阶段性。研究资料显示，樟柳碱化学结构和东莨菪碱、山莨菪碱、阿托品等莨菪烷类生物碱相似[2]。早期研究资料也显示出樟柳碱可使电灼闭塞锥动脉并夹闭/打开颈动脉法所建立大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型异常升高的前脑钙含量和伊文思蓝含量明显降低，减少脑组织水肿[3]，然而目前关于樟柳碱的研究文献较陈旧，药理作用的研究报道集中于20世纪八九十年代，对其用药剂量不确定，药理作用机制揭示不充分，药理与临床研究方法都相对较落后，不良反应的防治不是很清楚，这些方面均有待进一步研究和评价，以更好地指导临床用药。

本研究拟采用线栓法制作急性大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO），采用氢溴酸樟柳碱预防给药的方式，考察氢溴酸樟柳碱抗急性脑缺血再灌注损伤作用。

1 实验材料

1.1 实验药物

氢溴酸樟柳碱，由成都第一药业有限公司提供，批号140903。阳性药物为尼莫地平注射液（规格为50 mL:10 mg），由拜耳医药保健有限公司广州分公司生产，批号BXGVZ71。

1.2 实验动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体重（300±20）g，四川省中医药科学院实验动物中心提供，质量合格证号:SCXK(川)2013-19。

1.3 主要试剂

水合氯醛，成都市科龙化工试剂厂，批号2015090602； 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），sigma公司，批号LotBCBP3272V；大鼠血清NO试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20151113；NOS试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20151104；大鼠乙酰胆碱（Ach）酶联免疫分析试剂盒、乙酰胆碱酯酶（AchE）酶联免疫试剂盒，美国R﹠D公司,批号Lot 201511。

1.4 主要仪器

FA2004B型电子天平，上海越平科学仪器有限公司生产；TDZ4A-WS台式低速离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司生产；Enspire多标记微孔板检测仪，珀金埃尔默新加坡有限公司生产；DZKW-5-8电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司生产；DV1G-9070B智能型电热恒温鼓风干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司生产；EPED-E2-30TJ实验室级超纯水器，南京易普达科技发展有限公司生产等。

2 实验方法

大鼠购回后适应性饲养5 d，于第6 d按体重分组并尾静脉注射对应药物：假手术组和模型组（均注射生理盐水）、阳性对照组（尼莫地平，1 mg· kg-1）、氢溴酸樟柳碱大剂量组(1.2 mg·kg-1)、氢溴酸樟柳碱小剂量组(0.3 mg·kg-1),连续注射三天。于最后一次注射后半小时，采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，具体方法参照Zea Longa[4]方法加以改进：术前将大鼠禁食12 h，自由饮水，然后用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉，待翻正反射消失后，仰卧位固定，剪去颈部被毛，消毒，颈正中切口，于气管左侧找到颈总动脉（CCA），结扎CCA近心端、远心端被线，再分离颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），结扎ECA，在ICA远端放置动脉夹, CCA切口,沿切口插人直径为 0.286 mm、头端打磨光滑的标记鱼线，鱼线向ICA插入20 mm栓线进入ICA,穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉(ACA)近端，固定栓线，完全阻断大脑中动脉血供。缺血时间为2 h，再灌注时轻柔回抽鱼线10 mm。术中和术后保持室温 25℃左右，用白炽灯照动物使其肛温维持在(37±1)℃，直到恢复活动。模型成功的标志：(1)左侧Horner征；(2)右侧出现以前肢为重的偏瘫。假手术组除不插入鱼线外，其余操作同模型组。

2.1 神经行为缺陷的评分方法

大鼠在脑缺血 2 h再灌注 22 h后，按照Zea Longa[4]的五分制评分标准进行分级评分：无明显神经损伤症状0分；不能完全伸展对侧前爪1分；向对侧转圈2分；向对侧倾倒3分；不能自发行走，意识丧失4分。选择神经功能评分在1分及以上者(即造模成功者)进行后续实验。取脑时如发现蛛网膜下腔出血的大鼠则被剔除不予实验。

2.2 脑梗塞范围及脑组织含水量的测定[5]

大鼠在脑缺血2 h再灌注22 h后，断头取脑剔除嗅脑、低位脑干及小脑，称重后将脑组织做冠状切片，厚度为2 mm左右，然后立即置于2%的TTC(0.01 mol·L-1PBS配置)溶液当中，37℃避光孵育30 min，期间每15 min翻动一次。经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而脑梗塞区呈白色，将白色组织仔细分离，分别称重，以梗塞区脑质量与总切片脑质量的百分比作为梗塞范围。将染色后的脑组织置于105℃烤箱48 h烘干至恒重，对照大脑湿重按下述公式求出脑组织含水量：脑组织含水量 (%)=(1-脑组织干重／脑组织湿重 )×100% 。

2.3 生化指标检测方法

造模成功大鼠,于再灌注22 h后,股动脉采血，3500 rpm离心，取血清按试剂盒说明书测定血清NO、NOS、Ach、AchE。

2.4 统计方法

所有结果均采用SPSS17.0统计软件包建立实验结果数据库并进行one-way ANOVA 分析，以(x±s)表示各定量指标的平均值和分散程度。

3 实验结果

3.1 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠神经行为学评分、脑梗死面积及脑含水量的影响

由表1可知，在神经行为学评分方面：假手术组动物无明显神经功能缺损，评分均为0；其余缺血组动物均出现不同程度的神经功能缺损，表现为同侧horner征，病灶对侧前爪内收不能完全伸展，向右侧转圈等。氢溴酸樟柳碱小剂量组的神经行为学评分与模型组相比，有一定的改善，具有统计学意义，p＜0.05；大剂量组表现出改善神经行为学评分的趋势。在脑梗死面积方面：假手术组动物无脑梗死症状，评分为0，模型动物缺血侧脑组织梗死面积明显，氢溴酸樟柳碱各剂量组表现出减少缺血侧梗死面积的趋势，但无统计学意义。在脑组织含水量方面：模型动物脑组织的含水量与假手术组相比，明显增高，p＜0.01，氢溴酸樟柳碱小剂量组表现出降低脑组织含水量的趋势。

表1 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠神经行为学评分、脑梗死面积及脑含水量的影响（±s）

表1 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠神经行为学评分、脑梗死面积及脑含水量的影响（±s）

注：与假手术组比较，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；与模型组比较，* P＜0.05，**P＜0.01

组别 动物数 行为学评分 梗死面积（%）脑组织含水量（%）假手术组 8 0±0 0±0 78.52±0.07模型组 8 1.25±0.46▲▲17.28±4.92▲▲80.08±0.55▲▲阳性对照组 8 0.38±0.52**6.88±7.20** 79.98±1.18氢溴酸樟柳碱大剂量组 8 0.75±0.46 13.89±3.77 81.20±0.45氢溴酸樟柳碱小剂量组 8 0.63±0.52* 14.89±7.76 79.65±0.23

3.2 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠血清NO,NOS的影响

由表2可知：与假手术组相比，模型动物血清NOS明显增高，氢溴酸樟柳碱各剂量组有降低血清NOS的趋势，小剂量组还表现出降低血清NO的趋势。

表2 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠血清NO,NOS的影响(x±s)

3.3 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠血清Ach、AchE的影响

由表3可知：氢溴酸樟柳碱大剂量组表现出增加血清Ach的趋势，两个剂量组都表现出降低AchE的趋势。

表3 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠血清Ach、AchE含量的影响(±s)

表3 氢溴酸樟柳碱对缺血再灌注大鼠血清Ach、AchE含量的影响(±s)

注：与假手术组比较，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；与模型组比较，* P＜0.05，**P＜0.01

组别 动物数 Ach(pmol/L) AchE(U/L)假手术组 8 478.50±84.01 276.38±25.48模型组 8 465.08±60.84 268.54±39.65阳性对照组 8 541.80±48.27* 244.61±87.60氢溴酸樟柳碱大剂量组 8 477.72±51.19 256.92±66.76氢溴酸樟柳碱小剂量组 8 449.15±95.29 205.75±98.09

4 讨论

缺血性脑卒中的易发部位在大脑中动脉,该动脉的闭塞形成局灶性脑缺血。因此大鼠MCAO（middle cerebral artery occlusion）模型是公认的研究脑缺血损伤的标准动物模型。相比之下，线栓法局灶性脑缺血模型具有无需开颅、创伤小、不需要特殊设备、缺血区部位较恒定等特点为临床首选[6]，该模型也很好的模拟了临床上溶栓治疗后的血管再通过程,更贴近于临床表现，故而本研究采用此模型。本研究从模型动物的行为学评分、脑梗死面积、脑组织含水量及部分生化指标来评价，模型动物与假手术动物都有显著差异，表明造模成功。

从实验结果可以看出，氢溴酸樟柳碱预防给药对缺血再灌注大鼠的行为学评分有明显的改善，在脑梗死面积、脑组织含水量及NOS、NO及Ach方面也有一定的改善趋势，以及表现出降低AchE的趋势。目前的研究普遍认为脑缺血时胆碱能系统出现障碍，表现出Ach的减少及AchE活性的降低[7-8]，但也有研究表明乙酰胆碱酯酶活性抑制可改善实验性大鼠脑卒中的恢复[9]，董文哲等的研究也表明胆碱酯酶抑制剂新斯的明对缺血性脑损伤大鼠具有保护作用[10]。因此在该问题上还存在争议，尚需进一步研究确实。

目前有关脑缺血损伤的生化及分子机制主要涉及炎症介质释放与过氧化损伤，一氧化氮(NO)在脑缺血时的神经毒性作用、细胞凋亡、兴奋性氨基酸毒性、中枢胆碱能系统障碍等方面[11-12]，本研究只选择了两个剂量在预防给药的前提下就其中的两方面机制做了初步的探讨，但是缺血性脑卒中的病理生理过程是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应,病理机制非常复杂，至于本药物在其他剂量及其他给药方式下的作用及机制尚需进一步开展研究，这也是本课题下一步即将开展的工作。

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(责任编辑：陈思敏）

The protective effect of Anisodine Hydrobromide on acute cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

/CHEN Dan-dan1,2 , PENG Cheng1, XIE Xiao-fang1 , LIU Han 1, PAN Yuan1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan;,2 Ya’an Polytechnic college, Ya’an 625000 ,Sichuan)

Objective: To investigate the protective effect of Anisodine Hydrobromide on acute cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Method: The model of rat acute cerebral ischemia-reperfusion injury was established through middle cerebral artery occlusion-reperfusion. Anisodine Hydrobromide was injected before model establishment. The behavior, cerebral infarction size and water content of ischemic rats were evaluated, and the infuence on NO,NOS, Ach and AchE in serum were measured. Result: The low dose of Anisodine Hydrobromide could significantly improve the behavior of ischemic rats and show a tendency of decreasing infarct size water content, NOS activity and NO content. Large dose showed the tendency in improving behavior, infarct size, NOS activity and Ach content. Conclusion: Anisodine Hydrobromide has protective effect against brain damage induced by occlusion –reperfusion in middle cerebral artery of rats.

Anisodine Hydrobromide; acute cerebral ischemia-reperfusion injury; NOS; Ach

R 285.5

A

1674-926X(2016)06-009-03

1成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075 2 雅安职业技术学院 ，四川 雅安 625000

陈丹丹（1986-）,成都中医药大学在读博士研究生，就职于雅安职业技术学院，主要从事疾病动物模型与中药复方药理学研究

Email:chengdan88@126.com

彭成（1964-），研究员，主要从事疾病动物模型与中药复方药理研究

2016-04-01