大孔吸附树脂分离纯化苗药雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的研究

王小果 张汝国 王 明 司高飞

1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.黔南州外侨台港服务中心，贵州 都匀 558000；3.黔南州民族医药研究协会，贵州 都匀 558000



大孔吸附树脂分离纯化苗药雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的研究

王小果 张汝国 王 明 司高飞

1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.黔南州外侨台港服务中心，贵州 都匀 558000；3.黔南州民族医药研究协会，贵州 都匀 558000

目的：筛选出纯化苗药雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的最佳大孔树脂，并对影响分离纯化的主要因素进行探讨，确定最优工艺参数。方法：采用分光光度法和酶标法测定雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，并通过静态吸附和动态吸附两种方法筛选出最佳大孔树脂，以α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率为指标对优化后的工艺条件进行验证。结果：大孔树脂HPD600在室温下吸附效果最好，优化后的工艺参数为提取液pH=8.0、提取液体积与大孔树脂质量之比为1∶10，洗脱剂为70%乙醇溶液，洗脱体积为3BV。结论：纯化前后α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率提高约3倍，工艺稳定。

雪人参；大孔吸附树脂；α-葡萄糖苷酶抑制物质

近年来，糖尿病发病率逐年增大，已成为继肿瘤和心脑血管疾病后的第三大慢性疾病，因此侧重长期治疗且措施个体化，以达到控制病情、防止或减少并发症的目的[1]。而传统降糖药物对血糖的控制并不理想[2]。临床研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型口服降糖药物[3]，可以缓解高胰岛素血症和防治餐后高血糖症，还可以减少血糖波动对机体器官的损伤，提高糖耐量，具有非常广阔的应用前景。近年开发的伏格列波糖和米格列醇等作为治疗Ⅱ型糖尿病的首选药和Ⅰ型糖尿病的辅助药物已广泛应用于临床。

雪人参(RadixIndigofera)为豆科木蓝属植物茸毛木蓝的根，又名铁刷子、血人参、红苦刺和山红花，主要分布于云南、贵州、广西等地，具有抗氧化[4]、补虚活血、降血糖及调经舒筋等功效，在贵州苗族地区，药用历史悠久。其化学成分研究表明，其富含黄酮类、萜类、酚类等化合物[5-7]。李园园等[8]报道雪人参乙醇提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，但尚未见对雪人参乙醇提取物经大孔树脂纯化后对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究。本实验探讨了大孔树脂分离纯化雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的工艺条件，为α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备及应用提供新思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo Electron公司)；SP-75PC型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；FW-177型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；BSA224S-CW型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；HH系列数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)；PH-618型酸度计(上海仪电科学仪器有限公司)；96微孔酶标板，各型号微量进样器。

1.2 材料 雪人参采集于贵州省都匀市周边，用中草药粉碎机粉碎，过20～60目标准筛。4-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，美国Sigma公司)；α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，美国Sigma公司)；阿卡波糖(Acarbose，德国Serva公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，无水乙醇等均为分析纯试剂。

2 方法

2.1 大孔树脂的预处理 将D101、AB-8、HPD600、HPD100、X-5五种大孔树脂用95%乙醇浸泡24h后，用95%乙醇淋洗至流出液不浑浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇，备用。

2.2 雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的提取 称取雪人参粉末100g，加入一定量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次2h，合并提取液，离心，上清液减压蒸干，用20%二甲基亚砜溶液溶解后定容到1000mL容量瓶中，备用。

2.3 大孔树脂的筛选 分别称取5g上述5种大孔树脂于100mL锥形瓶中，加入80mL雪人参乙醇提取液(质量浓度为2.252mg/mL，下同)，常温下在振荡器上提取2h，静止24h后，离心分离，以α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率(简称酶活性抑制率)为指标，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量。酶活性抑制率越小，表明上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量越低，则该树脂的吸附性能就越好[9]。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制物质活性测定[10]在96微孔酶标板上，加入112μL磷酸钾缓冲液(pH=6.8)，8μL上述上清液和20μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶，混合均匀后，于37℃恒温箱中孵育30min，再加入20μL 4.0mmol/L PNPG开启反应，置于37℃恒温箱中反应30min，最后加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应，于405nm处测其OD值，根据下式计算出上清液中酶活性抑制率(用Y表示)，A0表示空白对照组OD值(不加样液)，Aj表示样品组OD值，由于雪人参乙醇提取液本身就有颜色，因此需要测定其背景吸收，并对测定结果进行校正。

Y=「(Ao-Ai)/A0」×100%

2.5 静态吸附

2.5.1 吸附时间 准确称取5g HPD600大孔树脂置于100mL锥形瓶中，加入80mL雪人参乙醇提取液，常温下振荡2h，静态吸附不同时间，离心，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。

2.5.2 吸附温度和树脂质量 分别称取不同质量的HPD600大孔树脂置于100mL锥形瓶中，加入提取液80mL，在15、20、25、30、35、40、50℃下振荡2h，静态吸附24h，离心，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。

2.6 动态吸附 分别称取5g上述5种树脂，装入30mm×300mm层析柱中，80mL提取液冲洗该柱，流速控制在2-3 BV/h，收集流出液，先用2BV去离子水冲洗层析柱，再用3BV 70%乙醇溶液洗脱，并收集流出液，减压蒸干后，用20%二甲基亚砜溶解，定容至50mL，测定α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。

2.6.1 提取液的pH值 称取5g HPD600大孔树脂7份，湿法装柱，用5%NaOH和1mol/L HCl溶液调节提取液的pH值分别为1.0、3.5、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0，使80mL不同pH值的提取液经过层析柱，以下按2.6步骤操作。

2.6.2 洗脱液的筛选 取5g HPD600大孔树脂，湿法装柱，使80mL提取液经过层析柱，吸附完全后，先用2BV去离子水冲洗，再分别用3BV 70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液洗脱，以下按2.6步骤操作。

2.6.3 洗脱液的体积分数 称取5g HPD600大孔树脂8份，湿法装柱，各使80mL提取液经过层析柱，吸附完全后，先用2BV去离子水冲洗，再分别用3BV 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇溶液洗脱，以下按2.6步骤操作。

2.6.4 洗脱液的用量 取5g HPD600大孔树脂，湿法装柱，使80mL提取液经过层析柱，吸附完全后，先用2BV去离子水冲洗，再分别用1、2、3、4、5BV 70%乙醇溶液洗脱，以下按2.6步骤操作。

3 结果

3.1 静态和动态吸附 5种大孔树脂对雪人参提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附情况如表1所示。被5种大孔树脂吸附后的提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率均有所下降，表明5种树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质均有吸附。但由于树脂的孔径、极性和比表面积等性质的不同，吸附能力亦不相同，其中， HPD-600的酶活性抑制率最低，说明该树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质吸附最多，效果最好，因此选为进一步实验的最佳树脂。

3.2 吸附速率 吸附速率是衡量吸附效果的重要指标。不同的吸附时间，大孔树脂对雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附效果也不相同，通过对大孔树脂HPD600吸附时间的考察后发现，前5h吸附速率较大，之后渐缓，表明该树脂在5h内已基本吸附完全。如图1。

3.3 温度和树脂质量对吸附效果的影响 25℃时，α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率最低，且随着HPD600树脂质量的增大，酶活性抑制率逐渐降低，在提取液体积(80mL)和树脂质量(5g)之比为16∶1时基本不再变化，表明该树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附达到饱和。如图2。

表1 5种树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质静态和动态吸附测定结果

3.4 提取液pH值 当雪人参乙醇提取液的pH值为8.0时，酶活性抑制率最低，表明HPD600树脂对提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附率最高，因此选择提取液pH值为8.0作为进一步实验的最佳酸度。详见图3。

3.5 洗脱条件的考察结果

3.5.1 洗脱液的确定实验 通过对70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液的洗脱效果进行考察后发现，70%乙醇溶液作为洗脱液时，α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率最高，如表2所示，表明洗脱效果最好，故选用为进一步实验的洗脱液。

3.5.2 洗脱液体积分数 随着乙醇溶液体积分数的增大，洗脱液中α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率逐渐增大，当乙醇浓度为70%时，曲线呈平缓趋势，考虑到经济成本，采用70%乙醇溶液即可达到较好的解吸效果。见图4。

表2 3种洗脱液对α-葡萄糖苷酶抑制物质洗脱效果

3.5.3 洗脱液用量 通过对1、2、3、4、5BV(1BV=25mL)洗脱液洗脱效果的考察后发现，从第3份洗脱液开始，其中的α-葡萄糖苷酶抑制物质已非常微量，表明3倍柱体积的70%乙醇溶液已能基本洗脱树脂所吸附的α-葡萄糖苷酶抑制物质，因此确定洗脱液的体积为3BV。

3.6 工艺验证 按照优化后的工艺参数，将100g雪人参粉末经回流提取所得的浸膏制成提取液，使80mL该提取液通过装有5g HPD600大孔吸附树脂的层析柱(30mm×300mm)中进行纯化，通过测定提取液纯化前后α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率验证纯化工艺效果，通过计算，纯化前雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率为37%，纯化后为71.23%，提高约3倍。

4 结论

通过对5种大孔吸附树脂吸附性能的考察，筛选出纯化苗药雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的大孔树脂为HPD600，并通过静态和动态吸附对影响分离纯化的主要因素进行优化，从而确定出HPD600树脂在室温下吸附，吸附时用5%NaOH和1mol/L HCl溶液调节提取液的pH值为8.0，提取液体积与大孔树脂质量之比为16∶1，采用70%乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱体积为3倍柱体积。经过大孔树脂纯化后的提取液，对α-葡萄糖苷酶抑制物质抑制率提高了约3倍，优化工艺稳定可行，希望为α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备和应用提供一定的参考。

[1]孔晓雯. 糖尿病药物治疗的研究进展[J]. 中国医药指南,2014,12(23):71-72.

[2] 吕娜,南敏伦,赵昱玮,等. α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展[J]. 黑龙江医药,2015,28(2):238-241.

[3] 刘瑞丽,丁美萍,徐雯,等. α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展[J]. 药物生物技术,2009,16(4):388-392.

[4] Li YY, Li CQ, Xu QT, et al. Antioxidant, α-glucosidase inhibitory activities in vitro and alloxan-induced diabetic rats’protective effect of Indigofera stachyodes Lindl. root[J]. J Med Plant Res,2011,5(14): 3321-3328.

[5] 杨雅欣,廖尚高,王正,等. 血人参水溶性化学成分的UHPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS分析[J]. 中国实验方剂学杂志,2014,20(23):63-67.

[6] 傅建,梁光义,张建新,等. 茸毛木蓝化学成分研究[J]. 现代药物与临床,2013,28(3):265-268.

[7] 裘璐,梁研,唐贵华,等. 茸毛木蓝根的化学成分研究[J]. 中成药,2013,35(2):320-323.

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[10]李英,张兰,杨万山. α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选和初步研究[J]. 上海大学学报(自然科学版),2000,6(2):129.

(编辑：梁志庆)

Separation and purification of α-Glucosidase inhibitor in Radix Indigofera by macroporous adsorption resin

WANG Xiaoguo1ZHANG Ruguo1WANG Ming2SI Gaofei3

1.Qiannan Medical College For Nationalities, Duyun 558000, China；2. The servicer of Foreign and Taiwan, Hongkong and Macao Affairs of Qiannan Prefecture, Duyun 558000, China;3. Qiannan Medical Research Association For Nationalities, Duyun 558000, China

To separate and purify the α-glucosidase inhibitor fromRadixIndigoferaby macroporous adsorption resin and establish optimum process for separating and purifying α-glucosidase inhibitor. The adsorption and desorption capacities of macroporous resins were investigated through examining the contents of the α-glucosidase inhibitor and the effects of several influencial factors on the abosorption of α-glucosidase inhibitor by macroporous resin were studied. Among 5 types of resins tested, HPD600 was shown to be the best, one for purification of α-glucosidase. The optimum ratio of herb to macroporous resin and pH value for HPD600 adsorption were 1/10 and 8.0 ethanol. After HPD600 resin purification the activity ofRadixIndigoferaα-glucosidase up to about 3 times. This research provided

for large-scale production of α-glucosidase ofRadixIndigofera.

RadixIndigofera; Macroporous Adsorption Resin; α-Glucosidase Inhibitor

2016-06-27

黔南医专基金项目(QNYZ201306)。

王小果(1982-)，女，硕士研究生，讲师，从事天然药物研究及相关教学工作。E-mail:450718418@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2016)18-0017-04