UHRF1表达下调对胃癌细胞增殖的抑制作用及机制

类维振，耿亚楠，韩东升，张伟，周林

（中国人民解放军第八十八医院，山东泰安271000）

UHRF1表达下调对胃癌细胞增殖的抑制作用及机制

类维振，耿亚楠，韩东升，张伟，周林

（中国人民解放军第八十八医院，山东泰安271000）

目的 探讨泛素样含PHD和环指域1（UHRF1）表达下调后对胃癌细胞增殖的抑制作用，并探讨其作用机制。方法 将培养好的人胃癌细胞系（MKN45）随机分为空白对照组、阴性对照组（shNC）和干扰组，后两组分别感染病毒shNC、shUHRF1，采用短发夹RNA（shRNA）技术下调MKN45细胞中UHRF1表达，XTT法测定各组细胞生长情况，平板克隆形成试验测算细胞克隆形成率，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率；裸鼠皮下成瘤试验检测细胞体内生长能力。结果 UHRF1表达下调后，MKN45细胞生长速度明显下降、克隆形成减少（P均＜0.05）；干扰组G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少（P均＜0.05），细胞凋亡率升高（P均＜0.05）；裸鼠皮下肿瘤生长速度下降（P＜0.01）。结论 下调UHRF1的表达能够抑制胃癌细胞增殖，该作用可能通过延长细胞周期进程和诱导细胞凋亡来实现的。

胃肿瘤；泛素样含PHD和环指域1；细胞增殖；细胞凋亡

胃癌是常见恶性肿瘤之一，包括中国在内的东亚地区是胃癌发病率和死亡率最高的地区［1］。胃癌的发生发展涉及多基因、多分子水平变化、多阶段的一个复杂过程，而基因的表观遗传学修饰在其中发挥重要作用［2］。泛素样含PHD和环指域1（UHRF1）作为重要的表观遗传学调节因子，参与DNA甲基化、细胞增殖和异染色质形成等过程［3］，并且在肝癌［4］、前列腺癌［5］和乳腺癌［6］等肿瘤中异常表达，与肿瘤形成密切相关。2014年6月～2015年12月，本研究通过分子生物学方法观察UHRF1基因沉默对胃癌细胞增殖的抑制作用，并探讨其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料 RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，RNA裂解液TRIzol购自美国Invitrogen公司；总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱，UHRF1和β-actin抗体购自北京中杉金桥公司；UHRF1 shRNA及病毒由上海吉凯基因公司合成；XTT试剂盒购自罗氏公司；RT-PCR试剂盒购自大连Takala公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，荧光定量PCR分析仪7500购自美国ABI公司；Annexin V／碘化丙啶（propidiumiodide，PI）检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2细胞培养、分组及转染 人胃癌细胞系（MKN45）来源于第四军医大学肿瘤生物学国家重点实验室，以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5%CO2的孵箱中常规培养。利用GV209载体构建UHRF1短发夹RNA（shRNA）（shUHRF1）和阴性对照（shNC）的慢病毒载体，滴度测定为1× 109TU／mL。将MKN45细胞铺于96孔板，随机分为空白对照组、阴性对照组（shNC）和干扰组（shUHRF1），待阴性对照组和干扰组细胞生长至50%时按病毒滴度10、50、100、200分别进行病毒感染，12 h后更换培养液，3 d后荧光显微镜下通过绿色荧光观察病毒感染情况。接着收集病毒滴度100、200的细胞进行扩大培养，流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞，进行后续实验。空白对照组不接受任何干扰。

1.3病毒感染后细胞中UHRF1蛋白表达检测 采用Western blotting法。裂解各组细胞后提取总蛋白，配制12%分离胶及5%积层胶，上样，电流恒定20 mA进行SDS-PAGE电泳50 min，用半干法转膜17 min（电压恒定20 V），5%脱脂奶粉于室温封闭20 min，2%脱脂奶粉稀释一抗（鼠抗人UHRF1单克隆抗体1∶400），4℃冰箱内孵育过夜。TBST洗涤，2%脱脂奶粉稀释HRP标记的二抗（羊抗鼠，1∶2 000），于室温孵育1～1.5 h，TBST洗涤，ECL显色，凝胶成像仪拍照（Biorad），QuantityOne软件进行定量分析，以空白对照组为参照，计算其他各组UHRF1蛋白相对表达量。

1.4细胞生长情况测定 采用XTT法。将各组细胞以1×103个／孔接种于96孔培养板，每组设5个复孔，共接种7块板，常规培养7 d，每天取出1块板进行检测。检测前将XTT标记试剂（最终浓度为0.3 mg／mL）和电子偶联试剂（PMS，N-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸盐）混合，每孔加入50 μL配好的混合液，与细胞共培养6 h，于酶标仪波长466 nm处检测吸光度值，对照波长为650 nm，由此绘制各组细胞生长曲线，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标。

1.5细胞克隆形成率测算 采用平板克隆形成试验。各组细胞按1×103个／孔接种于90 mm2培养皿内，培养2周后，待形成肉眼可见的集落时终止培养，PBS清洗3遍，甲醇固定15 min，用0.1%结晶紫溶液染色20 min，流水缓慢冲洗后晾干，计数细胞克隆数量，计算克隆形成率。

1.6细胞周期和凋亡检测 采用流式细胞术。收集各组细胞，调整细胞密度为1×106个／mL，用70%冰乙醇溶液固定。检测前PBS洗涤1次，加入含RNA酶的碘化丙啶，避光温育30 min后，流式细胞仪检测细胞周期，计算各周期细胞百分比及细胞凋亡率。实验重复3次取平均值。

1.7裸鼠皮下成瘤试验 BALB／C裸小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，4～6周龄，17～21 g，均为雌性。寄养在动物中心，选择恒温25～28℃、恒湿45%～50%的半屏障系统环境下饲养。裸鼠摄入的饲料和水均需灭菌处理。取对数生长期的MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1细胞，消化计数并调整细胞浓度至1×107／mL，用注射器抽取MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1细胞悬液分别注入裸鼠尾右侧和左侧后背，每点0.2 mL（含活细胞数2×106个）。每次取5只裸鼠，实验重复3次。每2天测量肿瘤1次，体积＝（D×d2）／2，其中D为最长直径，d为最短直径。4周后处死裸鼠，称量肿瘤质量。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料用±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组UHRF1蛋白表达 空白对照组、阴性对照组和干扰组UHRF1蛋白相对表达量分别为1.00 ±0.00、1.05±0.13、0.09±0.01，与其他两组比较，shUHRF1组UHRF1蛋白表达降低（P均＜0.05）。

2.2下调UHRF1表达对MKN45细胞增殖、凋亡的影响 见图1、表1。

2.3下调UHRF1表达对MKN45体内成瘤能力的影响 将MKN45-shNC和MKN45-shUHRF1细胞分别注射于裸鼠两侧皮下，经过4周观察后发现：注射MKN45-shUHRF1细胞的瘤体生长速度慢于注射MKN45-shNC细胞的瘤体；4周后同一只裸鼠MKN45-shNC侧瘤体体积明显大于MKN45-shUHRF1侧，两组瘤体的质量分别为（1.07±0.26）、（0.48±0.18）g，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　MKN45细胞生长曲线

表1　下调UHRF1表达对MKN45细胞增殖、凋亡的影响（%±s）

表1　下调UHRF1表达对MKN45细胞增殖、凋亡的影响（%±s）

注：与干扰组比较，*P＜0.05。

组别细胞克隆形成率G0／G1期细胞S 期细胞细胞凋亡率空白对照组100±0*50.34±5.03*30.31±2.06*6.53±1.85*阴性对照组96±11*49.98±4.61*30.01±2.72*7.69±1.62*干扰组54±1168.46±3.0619.27±1.6413.94±2.06

3　讨论

UHRF1是UHRF超家族成员之一，又称ICBP90，包含N端泛素样结构域UBL、植物同源性PHD结构域、SRA结构域和C端的环状RING结构域的蛋白质，可与DNA甲基转移酶、组蛋白去乙酰化酶及组蛋白甲基转移酶相互作用，实现对DNA甲基化、组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化的调控，从而参与细胞增殖、周期转换及DNA损伤修复等生物学过程，是一种重要的表观遗传调控因子［7］。研究发现抑制UHRF1表达可增强和恢复抑癌基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡［8］。Unoki等［9］研究发现，E2F-1调控UHRF1促进细胞G1／S期转换。UHRF1在肝癌［4］、乳腺癌［8］和膀胱癌［10］等肿瘤中异常高表达，在癌旁组织中的表达低于癌组织。证实了UHRF1在DNA甲基化、促细胞增殖和抗凋亡以及肿瘤发生发展中发挥重要作用。

本课题组前期通过免疫组织化学方法发现，胃癌组织中UHRF1表达显著高于癌旁组织，其表达与胃癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移密切相关，而与患者年龄和性别无关，并且UHRF1表达强度可以作为胃癌患者预后的重要指标［11］。该结果初步提示了UHRF1在胃癌的发生发展中发挥重要作用，是一种潜在的癌基因。本研究首先通过RT-PCR法检测发现胃癌组织中的UHRF1表达远高于癌旁组织，然后通过shRNA技术下调MKN45细胞中的UHRF1表达后，细胞生长速度显著下降，其中G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，从而特异性地抑制了细胞分裂，使细胞增殖速度减慢，并且能够促进细胞凋亡。研究表明，UHRF1在维持DNA甲基化包括肿瘤抑癌基因的启动子甲基化方面非常重要，如果这种维持作用被破坏，各种基因的随机表达将被触发，细胞内的稳态失衡，导致细胞凋亡或者细胞周期阻滞［12］。

综上所述，下调UHRF1的表达可促进胃癌细胞凋亡、延长细胞周期进程从而抑制胃癌细胞生长。这一发现有助于进一步阐明胃癌的发生机制，并可望为胃癌防治提供新的靶标。

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Inhibitory effect of down-regulated expression of UHRF1
on cell proliferation of gastric cancer

LEI Weizhen，GENG Yanan，HAN Dongsheng，ZHANG Wei，ZHOU Lin
（1 The 88th Hospital of PLA，Taian 271000，China）

Objective To investigate the inhibitory effect of down-regulated expression of ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1（UHRF1）on cell proliferation of gastric cancer（GC）and to explore its mechanism.Methods The gastric cancer cell line（MKN45）were randomly divided into the blank control group，the negative control group（shNC group）and the interference group（shUHRF1 group）；the latter two group were infected with shNC and shUHRF1.After UHRF1 expression was down-regulated by shRNA in MKN45 cells，the cell growth was examined by XTT and the clone formation rate was calculated by plate clone formation assay.Cell cycle and apoptosis of MKN45 cells were detected by flow cytometry（FCM）.In vivo tumorigenicity assay was conducted to examine growth ability in vivo.Results After UHRF1 expression was down-regulated in MKN45 cells by shRNA，the cell growth significantly decreased and colony formation reduced（all P＜0.05）.In the shUHRF1 group，the proportion of cells in G0／G1 phase increased and in S phase decreased，the apoptosis rate was increased and the difference was statistically significant（all P＜0.05）.The tumor growth rate in nude mice was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion The down-regulation of UHRF1 expression may inhibit the proliferation of gastric cancer possibly through extending the cell cycle progression and inducing cell apoptosis.

gastric neoplasms；ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1；cell proliferation；apoptosis

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.003

R735.2

A

1002-266X（2016）21-0007-03

国家自然科学基金资助项目（81402337）。

类维振（1987-），男，护师，本科，主要研究方向为胃癌的增殖与转移机制。E-mail：122238256＠qq.com

简介：周林（1988-），男，主治医师，博士，主要研究方向为胃肠道肿瘤的基础与临床。E-mail：zhoulin1105＠163.com

（2016-02-16）