miR-206对高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制

邵娟，吴基良，李敏才

（湖北科技学院，湖北咸宁437100）

miR-206对高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制

邵娟，吴基良，李敏才

（湖北科技学院，湖北咸宁437100）

目的 观察微小RNA-206（miR-206）对β-甘油磷酸钠（β-GP）诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化的影响，并探讨其机制。方法 取原代培养大鼠主动脉VSMCs并进行细胞鉴定。将VSMCs随机分为5组：空白对照组、模拟物阴性对照组、miR-206模拟物组、抑制物阴性对照组、miR-206抑制物组，用相应引物进行转染。转染后48 h，各组给予β-GP 10 mmol／L诱导VSMCs钙化。诱导4 d，茜素红染色镜下观察各组钙化情况，采用微量酶标法检测细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，采用免疫荧光法检测细胞缝隙连接蛋白43（Cx-43）表达。结果 VSMCs转染后48 h，经β-GP诱导4 d，与阴性对照组比较，miR-206模拟物组钙化结节减少，miR-206抑制物组钙化结节增多；与阴性对照组比较，miR-206模拟物组ALP活性及Cx43表达降低（P均＜0.05），miR-206抑制物组ALP活性及Cx43表达升高（P均＜0.05）。结论 miR-206可能通过调控Cx43表达抑制β-GP诱导的大鼠VSMCs钙化。

微小RNA-206；β-甘油磷酸钠；血管平滑肌细胞；钙化；大鼠

血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾衰竭等疾病普遍存在的病理改变［1］。既往研究认为，血管钙化是一个被动的钙磷沉积于血管壁的过程；但近年来发现血管钙化是一个主动的可调控的生物学过程［2］。微小RNA（miRNA）是一类由22个核苷酸组成小RNA分子［3］，通常在转录后调控基因表达，是近年来的研究热点。最近研究发现，miR-206参与了血管平滑肌细胞（VSMCs）的功能调节和心血管系统疾病的进程［4］，但具体机制尚不明确。2014年12月～2015年12月，本研究以高磷诱导的大鼠VSMCs钙化为基础，探讨miR-206对VSMC钙化的影响及可能的机制。

1　材料与方法

1.1动物、试剂及仪器 清洁级SD雄性大鼠15只，8周龄，180～200 g，购自武汉大学实验动物中心；DMEM／F12培养基（Hyclone）、FBS及Opti-MEM无血清培养基（Gibco）、Lipo2000（Invitrogen）、miR-206相关转染试剂（上海吉玛公司）；引物序列（由上海吉玛公司合成）：miR-206模拟物上游5′-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3′、下游5′-ACACACUUCCUUACAUUCCAUU-3′，模拟物阴性对照上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，miR-206抑制物序列5′-CCACACACUUCCUUACAUUCCA-3′，抑制物阴性对照序列5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′；茜素红、大鼠α-SMA抗体（Sigma）；细胞缝隙连接蛋白43（Cx-43）抗体、Runx2抗体（Abcam）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成生物公司）。

1.2VSMCs培养及鉴定 SD大鼠麻醉后迅速取出胸主动脉移至超净台内，无菌条件下纵行剪开血管，用棉签擦去内膜后剥离血管中膜并剪碎，用组织贴壁法进行原代培养，经自然纯化后，选取3～8代生长良好的VSMCs进行后续实验。取第3代VSMCs以1×105／孔的密度接种于放有灭菌盖玻片的六孔板内制作细胞爬片，待细胞贴壁生长至60%～70%融合时，去培养基，分别用免疫细胞荧光及化学染色法鉴定VSMCs特异性抗体α-SMA表达。经免疫荧光染色，胞质为绿色荧光；经免疫细胞化学染色，胞质为棕黄色，均呈阳性表达，具有VSMCs的表型特征。

1.3细胞分组与转染 将VSMCs随机分为5组：空白对照组、模拟物阴性对照组、miR-206模拟物组、抑制物阴性对照组、miR-206抑制物组。各组用Lipo2000按以下条件进行转染：VSMCs以2×105／孔的密度接种于六孔板，加入不含抗生素的DMEM／F12培养基培养至细胞融合度达70%时开始转染。各取相应引物10 μL（终浓度为100 nmol／L），另取Lipo2000 5 μL分别稀释于Opti-MEM无血清培养基250 μL中，静置5 min。将以上两种液体轻轻混匀，室温静置20 min形成复合物。将复合物滴入培养板中并轻轻晃动，置于37℃培养箱中培养，6 h后换为完全培养基继续培养。同时转染对照组。转染48 h后，各组细胞给予β-GP 10 mmol／L诱导VSMCs钙化，每2天更换1次培养液。经诱导4 d，去培养液，D-Hanks液洗3遍，用4%多聚甲醛固定15 min，D-Hanks液再洗3遍，加入1%茜素红室温孵育30 min，蒸馏水冲洗、干燥，倒置显微镜下观察到橘红色结节即为钙盐沉积。

1.4VSMCs内ALP活性测定 经β-GP诱导4 d，用微量酶标法检测VSMCs内ALP活性。按试剂盒说明书进行操作，结果用BCA法测定的细胞蛋白含量予以校正。每组设3个复孔，实验重复3次取均值。ALP活性计算公式：ALP活性（金氏单位／度（0.1 mg／mL）÷待测样本蛋白浓度（gprot／mL）。

1.5VSMCs内Cx43表达检测 采用免疫荧光法。β-GP诱导4 d取各组细胞，去培养液，加PBS洗5 min×3次，加4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤5 min×3次，加3%H2O2室温避光封闭20 min，PBS洗涤5 min×3次，加0.25%TritonX-100室温避光破膜20 min，PBS洗涤5 min×3次，加5%BSA避光封闭30 min，滴加1∶500稀释的兔抗Cx43（用PBS替代一抗作为空白对照）于湿盒内4℃孵育过夜；取出湿盒复温30 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加荧光标记的二抗室温避光孵育1 h，加入DAPI染核，用含抗荧光淬灭的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。使用IPP软件分析图像荧光强度。取6次实验结果平均值，并对结果进行标准化，将空白对照组荧光强度值设定为1，使用IPP软件直接测量绿色荧光强度值作为Cx43的相对表达量

1.6统计学方法 采用GraphPad Prism5统计软件。计量资料用±s表示，两组比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-206对高磷诱导VSMCs钙化结节的影响

VSMCs经β-GP诱导4 d，茜素红染色结果显示：与阴性对照组比较，miR-206模拟物组钙化结节减少，miR-206抑制物组钙化结节增多。

2.2miR-206对高磷诱导VSMCs内ALP活性及Cx43表达的影响 与阴性对照组比较，转染miR-206模拟物组ALP活性及Cx43蛋白表达降低（P均＜0.05），而转染miR-206抑制物组ALP活性及Cx43蛋白表达升高（P均＜0.05），见表1。

表1　各组ALP活性、Cx43表达比较（±s）

表1　各组ALP活性、Cx43表达比较（±s）

注：与模拟物阴性对照组比较，*P＜0.05；与抑制物阴性对照组比较，＃P＜0.05。

组别ALP活性（U／grot）Cx43（荧光强度）空白对照组257.62±13.051.00±0.13模拟物阴性对照组322.37±16.69169.08±11.72 miR-206模拟物组230.55±14.44*23.25±2.26*抑制物阴性对照组236.41±17.9310.91±1.27 miR-206抑制物组305.25±13.47＃211.73±18.88＃

3　讨论

血管钙化是心血管疾病致死的主要危险因素，特别是对于终末期肾病［5］。近年来，越来越多的证据表明，血管钙化是一个类似于骨形成的主动调节过程［6］，而VSMCs转化为成骨样细胞在促进血管钙化的过程中起关键作用［7］。VSMCs具有表型转换潜能，在一些因子刺激下，促进VSMCs向成骨样细胞转化，形成动脉中膜钙化。ALP是细胞成骨分化的早期检测指标，通过水解有机磷酸酯，使局部无机磷含量增加，促使磷酸钙沉积。茜素红染色是一种经典钙盐染色法，茜素红作为一种蒽醌类衍生物，能与钙盐结合形成橘红色复合物，是定性检测钙化的方法，可用于细胞成骨分化的晚期检测。

最近研究发现，很多miRNAs（miR-125b、miR-204、miR-205、miR-30b／c、miR-133a等）均能负向调控血管平滑肌细胞钙化过程［8～12］。本研究结果表明，VSMCs转染miR-206 mimics后48 h，经β-GP诱导4 d，与阴性对照组相比，ALP活性和钙化结节数目明显减少；而转染miR-206抑制物，与对照组相比，ALP活性和钙化结节数目均增加。表明miR-206可负向调控VSMCs成骨样分化，与以上文献报道一致。

缝隙连接是存在于相邻细胞间的膜通道结构，基本组成单位是Cx［13］。在心血管系统中，心肌细胞及VSMCs间存在着丰富的缝隙连接，主要表达产物为Cx43。Cx43也是成骨细胞中主要连接蛋白，为细胞骨化重要标记物之一。如小鼠基因敲除Cx43后，内皮素不能有效诱导细胞的骨化［11］，说明Cx43在骨基质合成、分泌和矿化中起重要作用。本研究发现，瞬时转染miR-206 mimics导致Cx43表达下调，而转染miR-206 inhibitor可以上调Cx43表达，提示miR-206可以负向调控Cx43表达。这与文献［15］报道miR-206负向调节Cx43表达，抑制C2C12细胞成骨分化过程相一致。

综上所述，上调miR-206表达能抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化，其作用机制可能与miR-206抑制Cx43表达有关。可为临床治疗血管钙化提供一个新的靶点。而Cx43具体通过何种途径调控VSMCs发生成骨样分化及miR-206是否通过其他途径调控VSMCs钙化尚需更进一步深入研究。

［1］O′Neill WC，Lomashvili KA.Recent progress in the treatment of vascular calcification［J］.Kidney Int，2010，78（12）：1232-1239.

［2］Thompson B，Towler DA.Arterial calcification and bone physiology：role of the bone-vascular axis［J］.Nat Rev Endocrinol，2012，8（9）：529-543.

［3］Pan Q，Luo X，Chegini N.Differential expression of microRNAs in myometrium and leiomyomas and regulation by ovarian steroids［J］.J Cell Mol Med，2008，12（1）：227-240.

［4］Radzikinas K，Aven L，Jiang Z，et al.A Shh／miR-206／BDNF cascade coordinates innervation and formation of airway smooth muscle［J］.J Neurosci，2011，31（43）：15407-15415.

［5］Yamada S，Taniguchi M，Tokumoto M，et al.The antioxidant tempol ameliorates arterial medial calcification in uremic rats：important role of oxidative stress in the pathogenesis of vascular calcification in chronic kidney disease［J］.J Bone Miner Res，2012，27（2）：474-485.

［6］Bobryshev YV.Transdifferentiation of smooth muscle cells into chondrocytes in atherosclerotic arteries in situ：implications for diffuse intimal calcification［J］.J Pathol，2005，205（5）：641-650.

［7］Speer MY，Yang HY，Brabb T，et al.Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries［J］.Circ Res，2009，104（6）：733-741.

［8］Goettsch C，Rauner M，Pacyna N，et al.miR-125b regulates calcification of vascular smooth muscle cells［J］.Am J Pathol，2011，179（4）：1594-1600.

［9］Cui RR，Li SJ，Liu LJ，et al.MicroRNA-204 regulates vascular smooth muscle cell calcification in vitro and in vivo［J］.Cardiovasc Res，2012，96（2）：320-329.

［10］Balderman JA，Lee HY，Mahoney CE，et al.Bone morphogenetic protein-2 decreases microRNA-30b and microRNA-30c to promote vascular smooth muscle cell calcification［J］.J Am Heart Assoc，2012，1（6）：e3905.

［11］Liao XB，Zhang ZY，Yuan K，et al.MiR-133a modulates osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cells［J］.Endocrinology，2013，154（9）：3344-3352.

［12］Qiao W，Chen L，Zhang M.MicroRNA-205 regulates the calcification and osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells［J］.Cell Physiol Biochem，2014，33（6）：1945-1953.

［13］Lopez D，Rodriguez-Sinovas A，Agullo E，et al.Replacement of connexin 43 by connexin 32 in a knock-in mice model attenuates aortic endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated relaxation［J］.Exp Physiol，2009，94（10）：1088-1097.

［14］Geneau G，Lamiche C，Niger C，et al.Effect of endothelin-1 on osteoblastic differentiation is modified by the level of connexin43：comparative study on calvarial osteoblastic cells isolated from Cx43+／-and Cx43+／+mice［J］.Cell Tissue Res，2010，340（1）：103-115.

［15］Inose H，Ochi H，Kimura A，et al.A microRNA regulatory mechanism of osteoblast differentiation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（49）：20794-20799.

Effect of miR-206 on high phosphorus-induced calcification in rat vascular smooth muscle cells

SHAO Juan，WU Jiliang，LI Mincai

（Hubei University of Science and Technology，Xianning 437100，China）

Objective To investigate the effect of microRNA-206（miR-206）on β-glycerophosphate（β-GP）-induced calcification in rat vascular smooth muscle cells（VSMCs）.Methods Aortal VSMCs were primarily cultured and identified in vitro.VSMCs were divided into five groups：control group，mimics negative control group，miR-206 mimic group，inhibitor negative control group and miR-206 inhibitor group.Each group was transfected by lipofectamine2000.After 48-hour transfection，each group was stimulated with 10 mmol／Lβ-GP to induce calcification of VSMCs.Observing calcium deposition with Alizarin red staining while detecting the alkaline phosphate（ALP）activity and the expression of connexin 43（Cx-43）respectively by Trace enzyme standard method and immunofluorescence method after induction for 4 days.Results After transfection 48 h，VSMCs were treated with β-GP for 4 days.Compared with the negative control group，the calcium deposition decreased in the miR-206 mimic group and increased in the miR-206 inhibitor group；the ALP activity and the expression of Cx43 decreased in the miR-206 mimic group and increased in the miR-206 inhibitor group（all P＜0.05）.Conclusions miR-206 may inhibit β-GP-induced calcification of VSMCs by regulating Cx43.

microRNA-206：β-glycerophosphate；vascular smooth muscle cells；calcification；rats

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.004

R543

A

1002-266X（2016）21-0010-03

国家自然科学基金资助项目（81270355）；湖北省自然科学基金资助项目（2014CFB211）。

邵娟（1988-），女，在读硕士，主要研究方向为动脉粥样硬化血管钙化的机制。E-mail：juanshaobhgs＠163.com

简介：李敏才（1974-），男，副教授，博士，主要研究方向为心血管病理。E-mail：mincaili＠163.com

（2016-02-20）