耐药肿瘤细胞中ClC-3、P-gp的表达变化及相关性

林嘉麟，施静雯，2，刘学强，余杰，徐彬，2

（1广东药学院生命科学与生物制药学院，广州510006；2广东省生物技术候选药物研究重点实验室）

耐药肿瘤细胞中ClC-3、P-gp的表达变化及相关性

林嘉麟1，施静雯1，2，刘学强1，余杰1，徐彬1，2

（1广东药学院生命科学与生物制药学院，广州510006；2广东省生物技术候选药物研究重点实验室）

目的 观察电压门控氯通道3（ClC-3）、P-糖蛋白（P-gp）在耐药肿瘤细胞中的表达变化，并探讨其相关性。方法 提取人肝癌细胞株BEL-7402及其氟尿嘧啶耐药株BEL-7402／FU、人结肠癌细胞株HCT-8及其紫杉醇耐药株HCT-8／T的总RNA和蛋白，用荧光定量PCR法检测细胞ClC-3和多药耐药基因1（MDR1）mRNA的表达，Western blotting法检测细胞ClC-3和P-gp蛋白的表达，采用线性相关分析ClC-3和P-gp蛋白表达的相关性。结果

耐药细胞BEL-7402／FU和HCT-8／T中ClC-3和P-gp的mRNA和蛋白水平都明显高于相对应的非耐药细胞BEL-7402和HCT-8（P均＜0.05），在耐药肿瘤细胞中，ClC-3与P-gp蛋白表达呈正相关（r＝0.98，P＜0.05）。结论ClC-3、P-gp在耐药肿瘤细胞中呈高表达，二者表达水平呈正相关关系。

肝肿瘤；结肠肿瘤；电压门控氯通道3；P-糖蛋白；肿瘤细胞；耐药性

电压门控氯通道3（ClC-3）普遍存在于哺乳动物细胞中，可能是容积激活性氯通道的通道蛋白或调节者［1］，对维持细胞增殖和分化等多种生理功能发挥重要作用。近年来研究发现，在宫颈癌、乳腺癌和膀胱癌组织中ClC-3的表达都远高于正常组织［2，3］。在肿瘤化疗应用过程中，多药耐药是制约化疗成功的主要原因之一。P-糖蛋白（P-gp）是多药

耐药基因1（MDR1）的蛋白产物，同时，P-gp也与容积激活性氯通道密切相关，参与了该通道的调控［4，5］。ClC-3与P-gp之间也可能有密切关系。2014年10月～2015年4月，本研究观察耐药和非耐药肿瘤细胞中ClC-3和P-gp的表达变化，并探讨二者的关系。

1　材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞非耐药株BEL-7402、人结肠癌细胞非耐药株HCT-8（本实验室保存），人肝癌氟尿嘧啶耐药株BEL-7402／FU、人结肠癌紫杉醇耐药株HCT-8／T（南京凯基生物公司），胎牛血清、RPMI1640培养液（美国Gibco公司），总RNA提取试剂TRIzol（美国Invitrogen公司），ClC-3、MDR1、β-actin引物（上海英潍捷基公司），细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、小鼠抗人GAPDH单抗、HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（碧云天生物技术研究所），兔抗人ClC-3多抗（英国Abcam公司），兔抗人P-gp多抗（美国GeneTex公司），化学发光试剂和PVDF膜（美国Bio-Rad公司），反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒（广州美津生物技术有限公司）。

1.2细胞培养 BEL-7402、HCT-8、BEL-7402／FU和HCT-8／T均培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，BEL-7402／FU加氟尿嘧啶20 μg／mL，HCT-8／T加入紫杉醇1 μg／mL，于37℃、5%的CO2培养箱中进行常规培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3肿瘤细胞中ClC-3、MDR1 mRNA表达检测采用荧光定量PCR法。收集对数生长期的4种细胞，按TRIzol试剂和反转录试剂盒说明书提取细胞总RNA，并反转录为cDNA。以cDNA为模板，应用荧光定量PCR试剂盒进行扩增。ClC-3上游引物5′-TTGCCTACTATCACCACGAC-3′，下游引物5′-GCATCTCCAACCCATTTACT-3′；MDR1上游引物5′-CAGAGGGGATGGTCAGTGTT-3′，下游引物5′-CGTGGTGGCAAACAATACAG-3′；β-Actin作为内参照，上游引物5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′，下游引物5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR反应体系：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板3 μL。反应条件：95℃60 s、95℃15 s、60℃15 s、72℃45 s，共40个循环。应用Bio-Rad MiniOpticonTM System进行数据分析，以2-ΔΔCt公式计算目的基因的相对表达量。

1.4肿瘤细胞中ClC-3、P-gp蛋白表达检测 采用Western blotting法。细胞培养至80%融合时，弃培养上清液，用冰冷的PBS漂洗细胞两次，加入细胞裂解液冰上裂解10 min，离心取上清液，蛋白浓度用BCA法测定，蛋白用10%SDS-PAGE电泳分离，并电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入ClC-3和P-gp兔抗人多抗及GADPH小鼠抗人单抗，4℃孵育过夜；TBS洗膜后，加入相应二抗室温孵育2 h；TBS洗膜，加入化学发光试剂，X线胶片曝光、显影和定影；扫描胶片，采用Image J软件分析，以目的条带与内参条带灰度值之比表示ClC-3和P-gp的蛋白相对表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；采用线性相关分析耐药肿瘤细胞中ClC-3与P-gp表达水平的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各类细胞中ClC-3、MDR1 mRNA表达比较

耐药细胞BEL-7402／FU、耐药细胞HCT-8／T中ClC-3、MDR1 mRNA相对表达量均高于相对应的非耐药细胞BEL-7402、非耐药细胞HCT-8（P均＜0.05）。见表1。

表1　各类细胞中ClC-3、MDR1 mRNA相对表达量比较（±s）

表1　各类细胞中ClC-3、MDR1 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与BEL-7402比较，*P＜0.05；与HCT-8比较，＃P＜0.05。

细胞类型ClC-3 mRNAMDR1 mRNA BEL-7402／FU4.68±0.42*3.25±0.31*HCT-8／T7.26±0.37＃4.36±0.29＃BEL-74021.00±0.001.00±0.00 HCT-81.00±0.001.00±0.00

图1　各类细胞中ClC-3、P-gp蛋白表达水平

2.2各类细胞中ClC-3、P-gp蛋白表达比较 耐药细胞BEL-7402／FU、耐药细胞HCT-8／T中ClC-3、P-gp蛋白相对表达量均高于相对应的非耐药细胞BEL-7402、非耐药细胞HCT-8（P均＜0.05）。见图1、表2。

表2　各类细胞中ClC-3、P-gp蛋白相对表达量比较（±s）

表2　各类细胞中ClC-3、P-gp蛋白相对表达量比较（±s）

注：与BEL-7402比较，*P＜0.05；与HCT-8比较，＃P＜0.05。

细胞类型ClC-3P-gp BEL-7402／FU1.05±0.06*0.45±0.05*HCT-8／T1.20±0.07＃0.61±0.04＃BEL-74020.40±0.050.21±0.04 HCT-80.18±0.030.10±0.02

2.3耐药肿瘤细胞中ClC-3与P-gp蛋白表达的相关性 在耐药肿瘤细胞中，ClC-3与P-gp蛋白表达呈正相关（r＝0.98，P＜0.05）。

3　讨论

ClC-3是电压门控性氯离子通道家族的成员，近年来研究发现，其不仅参与细胞增殖、分化和迁移等生理过程，在肿瘤细胞的生命活动中也起着重要作用［6］。研究发现，ClC-3参与了紫杉醇诱导的鼻咽癌细胞CNE-2Z早期凋亡的过程［7］。过表达ClC-3能显著抑制毒胡萝卜内酯诱导的鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡，下调ClC-3的表达则促进细胞凋亡［8］。ClC-3可不依赖于其离子通道属性促进与肿瘤转移相关的细胞膜皱褶形成，在肿瘤转移中扮演关键性的角色［9］。本研究结果显示，肝癌和结肠癌细胞中都表达ClC-3，而且耐药细胞株的表达水平明显高于非耐药细胞株。应用siRNA抑制ClC-3的表达，可抑制人胶质瘤U251细胞自噬而增强顺铂对细胞的毒性［10］；相反，当顺铂作用于稳定增加ClC-3表达的宫颈癌细胞HeLa时，对该细胞增殖的抑制作用显著降低［11］。可见，多种组织来源肿瘤的研究结果都显示ClC-3高表达在诱导肿瘤细胞耐药中起重要作用。

目前癌症治疗失败的原因主要在于肿瘤的转移，其次就是肿瘤耐药［12］，而多药耐药则是大部分肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的主要机制。P-gp是MDR1编码的胞膜糖蛋白，当药物进入细胞后，同药物分子结合，同时其ATP位点结合ATP后释放能量使药物转移到细胞外，从而使细胞内药物浓度始终维持在低水平，由此获得耐药性［13］。本研究证实，肝癌和结肠癌的耐药细胞株MDR1基因及其表达产物P-gp的表达水平均明显高于非耐药细胞株，故认为高表达P-gp是其产生耐药的原因。耐药细胞同时高表达ClC-3和P-gp，且ClC-3和P-gp的表达呈正相关，说明两者之间可能是一种正向调控，但究竟是ClC-3还是P-gp处于调控的上游，需进行进一步研究。

综上所述，ClC-3在肿瘤细胞耐药中起重要作用，可能与调控P-gp的表达有关，但其确切的调控方式有待于进一步研究探讨。

［1］Yin Z，Tong Y，Zhu H，et al.ClC-3 is required for LPA-activated Cl-current activity and fibroblast-to-myofibroblast differentiation［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2008，294（2）：C535-C542.

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［4］陈丽新，王立伟，Jacob T.MDR1基因在睫状体色素上皮细胞容积激活性氯电流中的作用［J］.生理学报，2002，53（1）：1-6.

［5］Altenberg GA.The multidrug resistance protein P-glycoprotein and the regulation of chloride channels［J］.Leuk Res，2005，29（9）：983-984.

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［7］Zhang H，Li H，Yang L，et al.The ClC-3 chloride channel associated with microtubules is a target of paclitaxel in its induced-apoptosis［J］.Sci Rep，2013（3）：2615.

［8］Zhang HN，Zhou JG，Qiu QY，et al.ClC-3 chloride channel prevents apoptosis induced by thapsigargin in PC12 cells［J］.Apoptosis，2006，11（3）：327-336.

［9］Xu B，Jin X，Min L，et al.Chloride channel-3 promotes tumor metastasis by regulating membrane ruffling and is associated with poor survival［J］.Oncotarget，2015，6（4）：2434-2450.

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［12］Simpson NE，Lambert WM，Watkins R，et al.High levels of Hsp90 cochaperone p23 promote tumor progression and poor prognosis in breast cancer by increasing lymph node metastases and drug resistance［J］.Cancer Res，2010，70（21）：8446-8456.

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ClC-3 and P-gp expression and their correlation in drug-resistant tumor cells

LIN Jialin1，SHI Jingwen，LIU Xueqiang，YU Jie，XU Bin

（1 Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To observe the expression changes of voltage-gated chloride channel 3（ClC-3）and P-glycoprotein（P-gp）in drug-resistant tumor cells，and to explore their correlation.Methods Total RNAs and proteins were isolated from human hepatic cancer cell line BEL-7402 and fluorouracil-resistant cell line BEL-7402／FU，human colonic cancer cell line HCT-8 and paclitaxel-resistant cell line HCT-8／T.The expression levels of ClC-3 and multidrug resistance 1（MDR1）mRNAs were assessed by real-time fluorescence quantitative PCR，the expression levels of ClC-3 protein and P-gp were determined by Western blotting.Linear correlational analysis method was used to analyze the correlation of ClC-3 protein and P-gp.Results With regarded to comparison between BEL-7402 and BEL-7402／FU as well as between HCT-8 and HCT-8／T，the expression levels of MDR1 and ClC-3 mRNA and P-gp and ClC-3 protein were significantly higher in drug-resistant cells than non-resistant cells（all P＜0.05）.ClC-3 protein and P-gp expression levels were positively correlated with each other（r＝0.98，P＜0.05）.Conclusion The ClC-3 and P-gp is highly expressed in drug-resistant tumor cells，and their expression levels are positively correlated.

liver neoplasms；colonic neoplasms；voltage-gated chloride channel 3；P-glycoprotein；tumor cells；drug resistance

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.005

R73-3

A

1002-266X（2016）21-0013-03

国家自然科学基金资助项目（81101666）。

林嘉麟（1991-），男，硕士，主要研究方向为氯离子通道与肿瘤耐药。E-mail：galuen＠sina.com

简介：徐彬（1975-），女，副教授，博士，主要研究方向为离子通道转化医学。E-mail：xubin2003＠163.com

（2016-01-14）