四种提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA方法的比较

白颉　郭慈浩　罗智强　陈栋

1.浙江省舟山出入境检验检疫局，浙江舟山316000；2.浙江省温州市疾病预防控制中心，浙江温州325000

四种提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA方法的比较

白颉1郭慈浩1罗智强1陈栋2

1.浙江省舟山出入境检验检疫局，浙江舟山316000；2.浙江省温州市疾病预防控制中心，浙江温州325000

目的比较四种联合提取诺如病毒和副溶血性弧菌总RNA的方法。方法使用Trizol法、磁珠法、QiagenTMRNA Mini Kit和柱式RNA抽提试剂盒分别提取诺如病毒和副溶血性弧菌的总RNA，经核酸测定仪检测RNA的质量，并用RT-PCR法对四种提取方法进行比较。结果QiagenTMRNA Mini Kit的提取效率最佳，对PCR的反应影响最小。磁珠法其次，但是磁珠法提取出的总RNA纯度也较高。Trizol法和柱式法总RNA抽提试剂盒所获得的总RNA比上述两者低，且存在不同程度的污染。经随机区组方差分析显示，四种提取方法之间存在显著性差异，F浓度=11.313；F（A260/A280）=15.093；F（A260/A230）=11.155，P均＜0.05。结论四种试剂的实际提取效率存在差异，应根据不同的样本情况选择合适的试剂。

诺如病毒；副溶血性弧菌；总RNA；逆转录PCR；提取

RNA是微生物中重要的遗传分子，获取高品质的RNA是样本前处理的基本要求，是后续进行分子生物学实验提供优质模板的前提。虽然国内已经建立了相对成熟的RNA提取方法，但是缺乏联合提取病毒和细菌两种不同病原微生物RNA的相关报道。目前国内市场上常见的RNA提取试剂有Qiagen的RNA MiniKit，PROGEMA的SV TotalRNA Isolation System，上海生工的柱式Trizol总RNA抽提试剂盒以及上海之江的磁珠柱RNA抽提试剂盒。除此之外，张倩等[1]用改良SDS/酚法提取总RNA，提取得到的产物完整性强、质量好、产率高，适合进一步的分子生物学实验研究。但是不同的提取原理以及不同的品牌对RNA的提取浓度和纯度有着巨大的差异。而提取高质量的RNA用以研究病原微生物的毒力基因表达、致病性和环境适应性变得尤为重要。本研究尝试以诺如病毒和副溶血性弧菌的总RNA提取为例，使用Trizol法、磁珠法核酸提取试剂盒、QiagenTMRNA Mini Kit和柱式总RNA抽提试剂盒四种方法提取总RNA，经核酸测定仪检测RNA的质量，并用RT-PCR法对四种提取方法进行比较，寻找出更适合用于两种病原体总RNA的提取。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验样本副溶血型弧菌菌株2株，由舟山检验检疫科学技术研究院赠送。诺如病毒Ⅰ型和Ⅱ样本各2株，均分离自临床确证样本。

1.1.2试剂和试剂盒Trizol采购于Invitrogen公司；磁珠法核酸提取试剂盒采购于A公司；柱式总RNA抽提试剂盒采购于B公司；QiagenTMRNA Mini Kit采购于Qiagen公司；DNaseⅠ采购于fermentas；β-巯基乙醇、氯仿、异丙醇、Tris饱和酚均购自北京化学试剂公司；Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、PVP均购于sigma。

1.2实验方法

1.2.1Trizol法提取副溶血性弧菌和诺如病毒的总RNA取0.5 mL副溶血性弧菌菌液（诺如病毒保存液）于1.5 mL灭菌离心管中，再加入Trizol 1 mL，充分混匀，室温放置10 min，保证病毒外壳充分裂解；加入200μL氯仿，震荡混匀使溶液充分乳化；12000 rpm离心15 min，取上清液转移到新的1.5 mL离心管中，加入500μL异丙醇，充分混匀后室温放置10 min；再以4℃，10000 rpm离心10 min，去除上清液；加入700μL，75%乙醇洗涤，让RNA沉淀悬起来，12000 rpm 4℃离心5 min，用枪小心吸去所有上清，干燥5 min；加入40μL ddH2O溶解，-70℃保存。

1.2.2磁珠法提取副溶血性弧菌和诺如病毒的总RNA按试剂盒说明书操作，获得的总RNA于-70℃保存。

1.2.3QiagenTMRNA Mini Kit法提取副溶血性弧菌和诺如病毒的总RNA按试剂盒说明书操作，获得的总RNA于-70℃保存。

1.2.4柱式法提取副溶血性弧菌和诺如病毒的总RNA按试剂盒说明书操作，获得的总RNA于-70℃保存。

1.3总RNA的纯化和质量检测

1.3.1总RNA的纯化用40μL缓冲液、5μL 0.09 M的MnCl2和5μL的DNaseⅠ配制成DNaseⅠ混合液，加入上述提取的总RNA中，室温保持15 min，确保降解残留的少量DNA，得到纯净的RNA。

1.3.2纯化后总RNA的质量检测（1）Nanodrop检测纯化后总RNA的质量：取2μL总RNA溶液，测定并计算其浓度、A280、A260和A230等检测值。（2）RT-PCR检测总RNA质量：分别设计Ⅰ型诺如病毒、Ⅱ型诺如病毒和副溶血性弧菌的特异性引物以检测总RNA的提取质量。引物及探针由大连宝生物工程有限公司，具体序列见表1。RT-PCR反应体系按照Prime ScriptTMRT-PCR Kit试剂盒说明书进行。混匀后置于荧光定量PCR仪中95℃5 min预变性，95℃30 s→60℃30 s（荧光信号检测），40个循环。

1.4统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件对总RNA质量检测结果进行随机区组方差分析，比较总RNA的提取效果，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　NV和VP荧光定量RT-PCR引物及探针

2　结果

2.1纯化后总RNA的质量检测

四种不同方法提取副溶血性弧菌和诺如病毒总RNA的结果有较大差异。从总RNA的纯度来比较，QiagenTMRNA Mini Kit优于磁珠法，Trizol法和柱式法较差。从总RNA的浓度来比较，QiagenTMRNA Mini Kit优于Trizol法和柱式法，磁珠法较差。四种提取方法的提取效率存在显著性差异，其中体现核酸浓度的F=11.313；体现核酸纯度的F（A260/A280）=15.093；体现核酸污染的F（A260/A230）=11.155，P均＜0.05。见表2。

表2　四种方法提取总RNA浓度和纯度

2.2 RT-PCR扩增检测总RNA质量

为了检测不同方法提取副溶血性弧菌和诺如病毒总RNA的提取效率，实验采用RT-PCR对总RNA中的特异性核酸片段进行扩增及分析[2-5]，从扩增曲线可以看出：所有病原体的特异性核酸均能扩增出，从Ct值的大小可以明显看出：磁珠法和QiagenTMRNA Mini Kit提取的总RNA对定量PCR的影响最小。4种提取方法提出副溶血性弧菌的RNA反转录后的cDNA产物进行的定量PCR结果，从前至后分别是Qiagen试剂盒、磁珠法、Trizol法、柱式RNA提取法，其中Trizol法和柱式法基本重合（封三图9）。4种提取方法提出诺如病毒Ⅰ型的RNA反转录后的cDNA产物进行的定量PCR结果，从前至后分别是Qiagen试剂盒、磁珠法、Trizol法、柱式RNA提取法，其中Qiagen试剂盒和磁珠法基本重合（封三图10）。四种提取方法提出诺如病毒II型的RNA反转录后的cDNA产物进行的定量PCR结果，从前至后分别是Qiagen试剂盒、磁珠法、Trizol法、柱式RNA提取法（封三图11）。

3　讨论

Trizol法、磁珠法、柱式法RNA提取试剂均是目前实际应用领域比较有代表性的总RNA提取试剂。从本文核酸浓度测定仪的检测结果可以发现：无论是诺如病毒还是副溶血性弧菌弧菌，利用QiagenTMRNA Mini Kit提取总RNA的浓度和纯度均要优于其他三种提取方法，磁珠法显示出较高的纯度，但存在浓度不高的情况。而Trizol法由于方法的原因，无论从浓度上还是纯度上看，均缺乏相应的优势。但是自Chomczynski发明Trizol方法的30多年来，Trizol法已经成为总RNA提取的经典方法，并得到了非常广泛的应用和改良，由于其试剂易于获得，试剂比例也便于调整，因此对改良Trizol法的研究也较多。这些均与国内多数研究提供的检测报道相符[2-5]。同时，由于样本间的差异，四种提取方法对于副溶血性弧菌的总RNA的提取效果要略高于诺如病毒。通过总RNA提取的后续荧光定量PCR检测，所有样本均扩增出了特异性核酸片段，但由于总RNA的提取效率不同，导致荧光定量PCR的检测结果也存在差异，QiagenTMRNA Mini Kit要优于其他提取方法的情况。

经检测，磁珠法和QiagenTMRNA Mini Kit提取出的总RNA纯度较高，与陈星等[6]报道相同。Trizol法和柱式总RNA抽提试剂盒提取的总RNA纯度相比以上两种方法较差，总RNA样品不纯，有蛋白质等杂质污染。其中磁珠法在提取总RNA的过程中不如预期，虽然其体现了安全无毒及快速方便的优势[7，8]，但由于国内部分检测试剂的制造工艺存在一定程度的不足，导致了磁珠法在检测过程中并不能高效的识别和结合核酸分子，致使其获得的总RNA浓度偏低，虽然在常规大样本的操作中能够满足检测需求，但在诸如痕量样本提取或盲样考核等能力验证活动中并不能取得令人满意的结果。而Qiagen的检测试剂虽然价格较高，操作相对繁琐，但其提取效率较高已经在国内达成了共识[9-11]。而Trizol法由于对实验人员的操作要求较高，因此可能在操作过程中会不同程度的产生污染，且不同人员之间操作产生的差异也较大[12，13]。柱式提取法为Trizol法的改进方法，不可避免存在操作上的误差，且其也存在制造工艺的问题而无法得到令人满意的提取效率[14，15]。

RNA的提取质量，是影响后续RT-PCR检测的重要环节。在RNA的提取步骤中如保护剂的干扰或样本外壳的裂解不完全，DNA污染、蛋白质或试剂残留，均是影响总RNA提取效率，造成总RNA浓度偏低的原因[16-18]。本文研究显示，QiagenTMRNA Mini Kit的提取效率最佳，对PCR的反应影响最小。磁珠法虽然浓度最低，但是磁珠法提取出的总RNA纯度较高，与QiagenTMRNA Mini Kit不相上下，在荧光定量PCR检测中具有一定的优势。而Trizol法和柱式总RNA抽提试剂盒所获得的总RNA纯度比较低，存在不同程度的污染。QiagenTMRNA Mini Kit、磁珠法和柱式总RNA抽提试剂盒是市面上常见的RNA抽提试剂盒，便于获取和操作。但是QiagenTMRNA Mini Kit成本偏高，在大量样本提取时需要考虑经费问题。Trizol法是传统的提取方法，试剂价格便宜但是操作过程复杂。因此如样本来源宝贵，且核酸拷贝数少，则倾向于选择QiagenTMRNA Mini Kit；如果样本量大，且核酸拷贝数大，则考虑磁珠法RNA抽提试剂盒；如需要用最低成本获得相对高浓度的RNA，则考虑选择Trizol法[19-21]。

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Comparison of four methods for extraction of total RNA of norovirus and vibrio parahaemolyticus

BAI Jie1GUO Cihao1LUO Zhiqiang1CHEN Dong2
1.Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau in Zhejiang Province,Zhoushan 316000,China；2.Wenzhou Center for Disease Prevention and Control in Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China

Objective To compare the four combined methods of total RNA extraction from norovirus and vibrio parahaemolyticus.Methods Total RNA was extracted from norovirus and vibrio parahaemolyticus with Trizol method,magnetic bead method,Qiagen RNA Mini Kit and column RNA extraction kit respectively.The quality of RNA was detected by nucleic acid analyzer,and the four extraction methods were compared by RT-PCR.Results QiagenTMRNA Mini Kit showed the best extraction efficiency and the least effect on PCR reaction.The bead method was ranked the second, but the purity of total RNA extracted by magnetic bead method was also higher.The total RNA obtained from total RNA extraction kit by Trizol method and column method was lower than the above two methods,and there were different degrees of contamination.The randomized block analysis showed that there were significant differences among the four extraction methods,with F concentration=11.313；F(A260/A280)=15.093；F(A260/A230)=11.155(P＜0.05).Conclusion The actual extraction efficiency of various reagents are different,and appropriate reagents should be selected according to different samples.

Norovirus；Vibrio parahaemolyticus；Total RNA；Reverse transcription PCR；Extraction

R332；Q933

B

1673-9701（2016）29-0127-04

浙江省公益基金资助课题（2014C33111）

（2016-08-10）