高危型人类乳头瘤病毒E7促进宫颈癌变的分子机制研究进展

陈春琴 邬素芳*

高危型人类乳头瘤病毒E7促进宫颈癌变的分子机制研究进展

陈春琴 邬素芳*

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。WHO于1992年宣布HPV病毒是引起宫颈癌变的首要因素。研究显示E6、E7癌蛋白分别使肿瘤抑癌基因p53和pRb失去活性，最终引起细胞生长失控，发生癌变。在已存在E6基因基础表达的HPV16感染细胞中，持续的E7基因表达对宫颈癌的维持是必要的［1］。高危型HPV病毒的E7基因表达的蛋白可干扰细胞周期、凋亡和染色体的稳定，最终导致细胞永生化，逐步演变成宫颈癌［2］。 HPV E7作为宫颈癌发生、演进的主要致癌蛋白，已引起人们的高度重视。本文就HPV E7在宫颈癌致病机制中的研究进展做一综述。

1 HPV E7蛋白的结构与功能

HPV属乳多空病毒科，乳头瘤病毒属，病毒颗粒直径约55nm，基因组约7.9 kb，相对分子质量为5×106。基因组分为3个功能区：（1）早期区（E区）约4.5 kb，含E1，E2，E4~E7 6个亚区。E1参与病毒复制，其编码蛋白具有ATP依赖性解旋酶的活性；E2参与转录调节，E2蛋白是主要的病毒转录因子；E4编码晚期胞质蛋白，与病毒成熟有关；E5具有较弱的转化活性；E6和E7主要与细胞转化及HPV的致癌性有关，编码HPV最主要的癌蛋白。（2）晚期区（L区）编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。Ll高度保守，是主要的种特异性抗原；L2高度可变，是型特异性抗原。（3）长调控区（LCR）位于E区起始端与L区末端之间，一般为800~900kb，含有DNA复制与表达的调控元件。

高危型HPV E7基因编码1个约100个氨基酸的小分子蛋白。E7蛋白包括3个CR区（con-served regions），CRl区是细胞转化及pRb降解所必需的，但不直接作用于与pRb的结合；CR2区含有与pRb结合的序列Leu-X-Cys-X-Glu（LxCxE）及2个丝氨酸位点，其可被蛋白激酶Ⅱ（Casein KinaseⅡ，CKⅡ）所磷酸化；在猿病毒40大T抗原（SV40LTAG）、腺病毒的ElA蛋白中也发现含有CRl区和CR2区；CR3区包含2个C-x-x-C的序列，构成一锌指结构，与pRb及其他宿主细胞蛋白质的相互作用以及E7蛋白二聚体的形成有关［3］。 E7通过位于C末端的锌指状结构形成二聚体；N末端的CRl和CR2区对E7蛋白的体外转化有重要作用。Elizabeth等［4］近期研究发现，E7拥有其他多瘤病毒小T抗原的部分功能，如类似猿猴病毒40型的功能，可通过剥夺有丝分裂原解除细胞周期G0期阻滞；同时有类似小鼠多瘤病毒的功能，可抑制肌母细胞的分化。

HPV感染过程中首先以低拷贝数感染基底细胞，然后环状DNA开始复制，被感染的基底细胞进入到上皮的增殖区域，病毒周期进入质粒期或游离基因持续期，此期病毒的基因表达最少，尤其是癌基因E6和E7的表达控制在较低水平。其后，伴随早期基因E6和E7的大量表达，全部病毒基因的表达均开始明显升高。El/E2是HPV所编码的复制酶，除El/E2蛋白外，其复制完全依赖于细胞的复制结构，但HPV复制过程却发生在分化并已退出细胞分裂周期的基底上细胞中，这些细胞缺少病毒复制所必需的蛋白等，需要宿主细胞退出分化，重新进入细胞周期，HPVE7起着关键作用［5］。

2 高危型HPV E7蛋白促进宫颈癌变的分子机制

2.1 高危型HPV E7干扰细胞周期促进宫颈癌变的发生机制 （1）高危型HPV E7结合并降解pRb蛋白的机制：视网膜母细胞瘤蛋白（protein of retionblas-toma，pRb）是一种抑癌蛋白，正常情况下，非磷酸化pRb与核转录因子E2F特异性结合，形成二者的复合物后，抑制E2F对靶基因的转录，使细胞停留在G1期，从而抑制细胞增殖。高危型HPV E7蛋白通过CR2区的LxCxE结构与pRb第649~672位氨基酸的口袋结构特异性结合，释放核转录因子E2F，诱发细胞从G1期进入S期，同时E7促使pRb蛋白进入泛素依赖的途径降解。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A（CIP2A）是最近被识别的一种在多种人类恶性肿瘤中过度表达的癌蛋白。Zhang等［6］近期研究表明，HPV16E7蛋白可以通过依赖pRB作用显著上调CIP2AmRNA及其蛋白表达。在敲除CIP2A基因的HPVE7阳性宫颈癌细胞中，细胞分裂受到显著抑制，DNA合成以及G1/S期的细胞周期进展停滞。除了pRb，E7还可以与pRb家族的其他2个成员-p107和p130结合，同样竞争与核转录因子E2F的结合，使E2F释放，致使细胞过度增殖、细胞周期调控失控，导致细胞的永生化，促进宫颈癌的发生［7］。同时，CR1作用pRb蛋白相关因子p600，导致细胞的转化并促进细胞增殖。E7还可以通过降低p300相关因子P/CAF乙酰化酶活性使pRb失活。 （2）高危型HPV E7结合E2F家族增强E2F介导的转录的机制：HPV E7蛋白可以直接结合转录因子E2F1，增强E2F1介导的转录作用，从而导致细胞不断增殖。CLaughlin-Drubin等研究认为，HPV E7蛋白能使E2F6的转录抑制功能失活，从而扰乱关键的细胞保护机制，导致HPV感染细胞的S期感应性增加，加速细胞的S期进程。其研究还认为，E2F6是Polycomb group（PcG）蛋白（PcG蛋白是一组通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子）复合物的组分之一，E2F6和PcG蛋白连接，共同抑制转录［8-9］。而表达E7的细胞E2F6/PcG复合物染色减少，这可能与E7蛋白对E2F6的抑制作用有关。因此E7蛋白通过E2F家族而影响细胞周期的机制可能是：E7蛋白使经典E2F转录活性增高，细胞为了抵抗这种转录的增强而大量表达起负反馈作用的E2F6，此时虽然E2F6大量表达，但其活性却被E7抑制，故细胞最终还是向增殖方向发展。（3）高危型HPV E7与转录因子家族的相互作用机制：E7能与核转录因子激活蛋白-1（Amphipathic Protein 1，AP-1）转录因子家族作用，AP-1转录因子家族包括C-Jun，JunB，C-Fos等，AP-1转录因子介导早期有丝分裂。有研究发现，一方面E7锌指状结构能与C-Jun的第224~249位氨基酸结合，激活细胞周期早期进展基因，在E7转化进程中起重要作用。另一方面E7的LxCxE结构能抑制pRb对C-Jun转录的兴奋，使细胞分化脱离细胞周期进展［10］。Neha Jaiswal等［11］近期研究表明，HPV16E7蛋白可通过干扰与结合酶Ubc9的相互作用，调节转录因子叉头框蛋白M1（Forkhead box M1b，FoxM1b）的翻译后小泛素化修饰，使FoxM1b蛋白的表达上调而促进转录。NF-KB是一种多项性多功能的核转录因子，其广泛存在于真核生物中，是一个复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。其转录调节许多重要的生理过程，包括急性期炎症免疫反应、细胞的生长凋亡和肿瘤的形成。而Vandermark等［12］的研究发现，E7和E6/E7可抑制HPV16感染的宫颈转化区上皮细胞中基础表达的和TNF-α所诱导的转录因子NF-kB的活性，从而导致细胞增殖和永生化。这可能与细胞差异性和宿主微环境有关。（4）高危型HPV E7与细胞周期相关蛋白的相互作用：细胞周期相关蛋白包括三大类：即细胞周期蛋白（cyclins含cyclin A，cyclin D，cyclin E等）、细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs，含CDK2，CDK4，CDK6等）和细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白（cyelin-dependent kinases inhibitory protein，CKI，含P16，P21，P27等）。细胞周期进程由三者进行精密调节。HPV感染时，E7蛋白可以与多种细胞周期蛋白相互作用，以多种方式扰乱正常细胞周期，从而促进细胞增殖。Nguyen等［13］研究认为，HPV 16 E7蛋白可以在不依赖pRb，p107或p130的情况下，与cyclin A/CDK2或cyclin E/ CDK2复合物连接，从而增强它们的活性，促进细胞从G1期进入S期或加快S期进程；HPV 6和HPV 11 E7蛋白也可以在pRb/p107/p130缺失的细胞中与CDK2复合物相互作用。此外，纯化的HPV 16 E7蛋白可以在体外与cyclin/CDK2相互作用。这些均表明HPV E7可以在缺少其他细胞连接蛋白的情况下直接与cyclin/CDK2复合物相互作用，增强它们促进细胞周期进程的作用。此外，研究发现，E7蛋白亦可抑制p27，p15和p21细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的作用，对G1期构成影响，进而使染色体异常复制，产生癌变引起细胞过度增殖［14］。E7能结合并灭活p21，克服p21介导的对Cyclin E和Cyelin A相关激酶CDK2的抑制，并能阻滞p21对依赖增殖细胞核抗原（PCNA）DNA复制的抑制作用，从而减弱p21的双重抑制作用。由于p21也可不依赖pRb来抑制E2F活性，因此导致p21抑制作用的进一步丧失。尽管E7能使细胞免于p53所介导的细胞周期阻滞，但表达E7细胞凋亡水平升高，这可能与DNA复制末期E7直接与CyclinA作用，导致依赖CyclinA的E2F失活过程的失效有关。2.2 高危型HPV E7抑制宫颈癌细胞MHC-I基因转录参与免疫逃避的机制 肿瘤细胞必须逃逸机体免疫系统的监视才能致病，而肿瘤细胞的免疫逃逸与组织相容性抗原I（MCH-I）分子的表达下调或缺失有关。已有研究证实，宫颈癌组织内MHC-I表达缺失与其基因各位点的突变、6p21区域的缺失、杂合缺失和基因转录异常等相关［15］。高危型HPV的早期基因E7能抑制MHC-I重链基因的启动子活性，充分表明E7可能通过抑制MHC-I重链基因转录的方式来影响MHC-I的表达。LI等［16］通过ChIP试验发现E7特异性结合在M HC-I启动子中的-184~-500bp区域；E7干扰后MHC-I启动子高乙酰化，说明了E7通过募集HDAC到MHC-I的启动子区导致启动子组蛋白去乙酰化从而抑制MHC-I表达。E7能结合IL-10 及TGF-β启动子，上调IL-10 及TGF-β表达，导致抗原介导的生长抑制效应失效，从而导致逃避宿主免疫反应［17］。此外，HPVE7有抑制IFN-γ介导的JAK1/ JAK2/STAT1信号转导通路中信号转导子及转录激活子1（signal transducer and activator of transcription l，STAT-1）磷酸化的功能，并导致干扰素调节因子1（interferon regulatory factor-1，IRF-1）以及抗原加工相关转运子1（transporter associated antigen processing subunit 1，TAP-1）的表达障碍，同时下调MHC-I类抗原的表达，从而逃避CTL的识别而逃避宿主的免疫监管。Jemon等［18］通过建立卵清蛋白抗原（Ova）诱导的模型小鼠发现，与HPV感染人类皮肤所观察到的现象一致，HPV16 E7表达的小鼠角质细胞中朗格汉斯细胞（LC）数量表达明显降低。这表明E7蛋白的独立作用可导致LC的损耗，并且强烈抑制Ova-特异性的皮肤区域淋巴结CD8+T细胞的应答反应 。

2.3 E7与组蛋白去乙酰化酶 、DNA甲基化酶、DNA去甲基化酶的作用 研究表明，E7能与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）、DNA甲基化酶等结合，从而影响基因的转录［19］。组蛋白甲基化酶EZH2是一个致癌因子，在正常细胞中，参与抑癌基因INK4A-ARF的抑制。在一些肿瘤细胞中过表达，可催化组蛋白H3赖氨酸K27位点三甲基化。Daniela等［20］研究表明，E7可促使EZH2的表达，对HPV感染宫颈癌细胞增殖及凋亡抑制具有重要作用。KDM6A是KDM6B的同源蛋白，属于含Jumonji家族结构域的组蛋白去甲基化酶（Jumonji domain-containing histone demethylase，JMJD）家族成员，可通过催化H3K27me3去甲基化，致使细胞周期受阻。Margaret E等［9］研究发现，HPV E7的表达通过甲基转移酶KDM6A和KDM6B的转录诱导导致组蛋白H3上37位的三甲基化赖氨酸H3K27me3标记减少。而HPVE7诱导KDM6B和其转录靶点p16INK4A的作用独立于Rb蛋白和E2F的活化作用。这些H3K27me3水平的变化和相关转录的改变由于消耗KDM6A和KDM6B抑制宫颈癌细胞的增殖在E7沉默后能迅速扭转，因此可见，E7表达将导致宿主在组蛋白甲基化水平的基因重排，而逐渐致癌。2.4 HPV E7降低基因组稳定性和导致DNA损伤的作用 高危型HPV E7蛋白可以导致中心体数目迅速增多，也可在正常细胞出现基因组不稳定性之前引起中心体数目的异常，从而干扰有丝分裂。E7表达的细胞，易出现染色体总数的非整倍性改变等数目异常，宿主染色体不稳定性增加和DNA损伤［21］。E7导致中心体复制错误的作用可能与CDK2的功能失调有关，CDK2被抑制后不仅可以延缓细胞增殖，亦可降低中心体相关的有丝分裂缺陷，从而降低宿主基因组稳定性。LINE-1基因即长散布重复元件1（long interspersed repeated element-1，LINE-1，L1）反转座子，是人类基因组的重要组成部分。5'UTR为约910 bp的非翻译区，其后为两个开放读码框：ORF1和ORF2。Diego E.Montoya-Durango［22］通过瞬态转录分析证实，E7单独或联合HDAC2可干扰Rb介导的L1启动子的转录，同时，E7可以解除L1MD-A5报告基因的转录应答而导致基因毒性。

3 讨论

2003年美国FAD批准将高危型HPV-DNA检测用于宫颈病变筛查，2006年首批宫颈癌疫苗上市。但是HPV疫苗的研制、使用、推广仍面临许多难题［23］。HPV作为宫颈癌发生发展的必要条件，已引起大家的重视。对HPV致病机制日益深入的研究将有助于多种预防性疫苗和治疗性疫苗的开发和应用，可逐渐减少宫颈癌对全世界女性健康的威胁，而宫颈癌也将可能成为第一种可以进行预防的恶性肿瘤。而HPV E7作为HPV主要的癌蛋白，其促进宫颈癌变的分子机制极其复杂，尚有待于进一步探究，从而为宫颈疾病的诊疗提供更多的理论依据。

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国家自然科学基金（81201541）；上海市浦江人才计划项目（12PJD002）

201600 上海交通大学附属第一人民医院

*通信作者