血小板衍生生长因子C对体外培养的人卵巢透明细胞癌细胞的增殖和趋化作用

李晓莹，郭希民，郭红延，潘凌亚

论 著

血小板衍生生长因子C对体外培养的人卵巢透明细胞癌细胞的增殖和趋化作用

李晓莹1，郭希民2，郭红延3，潘凌亚1

目的 观察血小板衍生生长因子-C(platelet-derived growth factor-C,PDGF-C)对体外培养的人卵巢透明细胞癌(ovarian clear cell carcinoma,OCCC)ES-2细胞的增殖和趋化作用。方法 体外培养ES-2细胞，添加不同浓度的PDGF-C进行干预，应用CCK8试剂盒法评价细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期，利用Transwell细胞迁移实验、细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果 与未加PDGF-C的对照组相比，PDGF-C能明显刺激ES-2细胞的增殖，在第4天增殖达高峰，PDGF-C促增殖最佳作用浓度是20 μg/L；经不同浓度PDGF-C的刺激，处于细胞周期G1期的ES-2细胞比例较对照组明显降低(P<0.05)，处于S期的ES-2细胞比例显著升高(P<0.05)，而处于G2+M期的细胞比例则无明显变化(P>0.05)。同时，PDGF-C提高了ES-2细胞的迁移能力。结论 PDGF-C可促进体外培养的ES-2细胞的增殖、迁移能力。

血小板衍生生长因子C；ES-2细胞系；细胞增殖；趋化作用

卵巢癌是常见恶性肿瘤之一，其病死率高居妇科恶性肿瘤之首[1, 2]。卵巢透明细胞癌(ovarian clear cell carcinoma, OCCC)是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)一种特殊的病理类型，约占卵巢癌的5%，其侵袭性强，易发生腹膜后淋巴结及实质器官如肝脏等部位转移，易发生耐药且复发性高，故而预后较差[3, 4]。

血管生成在肿瘤的发生、进展和转移中具有重要作用。血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)作为促进血管生成的一种重要因子，其过表达能促进肿瘤细胞增殖、迁移，并且能改变肿瘤微环境。PDGF-C作为新发现的PDGF家族成员，在多种上皮细胞肿瘤中均有表达，如乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌等[5-7]。PDGF-C有较强的促进血管新生能力[8,9]，可间接促进肿瘤的生长，但是它对肿瘤细胞本身的增殖和侵袭能力影响如何尚未有报道。因此，本研究旨在了解PDGF-C对卵巢透明细胞癌ES-2细胞增殖与迁移能力的影响，以期进一步揭示PDGF-C在卵巢癌的生长和转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ES-2(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)、PDGF-C(美国Peprotech公司)，细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)，CCK8检测试剂盒(日本同仁化学)，胎牛血清(HyClone Laboratories, Inc)，胰蛋白酶、McCOY’S5A培养液(上海Invitrogen公司)，CD133抗体(美国BD公司)，Transwell(孔径8 μl，美国Corning)。

1.2 仪器 CO2培养箱(美国Shell-Lab2323型)，超净工作台(YJ-875型，苏州净化设备)、流式细胞仪(美国Elite SP型)、荧光显微镜(日本Nikon公司)、酶标分析仪(美国Bio-RAD Model 550型)、细胞计数仪(美国FJ-2003型)。

1.3 ES-2细胞培养 ES-2细胞复苏后，以1×104/cm2的密度接种于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、100 U/ml青霉素G及100 g/ml 链霉素的McCOY’S5A培养液中，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中贴壁培养。

1.4 CCK8法ES-2细胞增殖实验 取对数生长期的ES-2细胞，消化离心后计数，以1×104个/ml的密度接种于96孔培养板，于孵箱常规培养12 h，分别加入浓度为10、20和40 μg/L的PDGF-C；同时设置对照组，加入等体积的PBS液。每组设置5个复孔，以换含PDGF-C培养液的时间为准，每天定时于每孔中加入CCK8试剂20 μl，孵育4 h后酶标仪检测各孔细胞于450 nm波长处的吸光度值，连续检测7 d。将检测结果以时间为横轴，吸光度为纵轴绘制生长曲线，计算细胞的存活率。

1.5 流式细胞仪法ES-2细胞周期检测 取ES-2细胞，以6×103个/cm2的密度接种于100 mm培养皿中，常规培养24 h，更换含2% FBS的培养液，继续培养24 h后，分别加入浓度为10、20和40 μg/L 的PDGF-C，对照组加入等体积的PBS。孵育24 h后，胰酶消化3 min，加入含血清培养液中和胰酶作用，轻轻吹打成细胞悬液，800 r/min离心5min，弃上清，PBS液漂洗3遍，细胞筛去除聚集的细胞团，PBS液重悬并将细胞密度调整为1.5×106/ml，加入-20 ℃预冷的70%乙醇溶液，于4 ℃过夜。PBS液充分漂洗后加入RNA酶10 μl，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)25 μl染色，置于4 ℃冰箱避光30 min，流式细胞仪检测细胞周期(激发波长488 nm)。

1.6 ES-2细胞划痕实验 将ES-2细胞以2×105/ml的密度接种在6孔培养板中常规培养24 h，更换含2% FBS的培养液，待细胞融合达80%后，每孔用200 μl无菌枪头纵向匀速划一道划痕，PBS液轻轻冲洗细胞，分别加入浓度为10、20和40 μg/L的PDGF-C培养液，对照组加入等体积PBS液。于0、12、24、36和48 h对细胞进行拍照，观察各组细胞向空白处迁移的情况。

1.7 Transwell细胞迁移实验 将50 mg/L 的Matrigel用PBS液稀释8倍，取1滴加于Transwell小室底部膜的下室面，在超净台内风干后备用。取对数生长期的ES-2细胞消化离心，将细胞密度调整为2×105/ml，取200 μl细胞悬液加入Transwell小室内，下室分别加入浓度为10、20和40 μg/L的PDGF-C培养液500 μl，设立对照组并加入等体积PBS液。孵育24 h后取出，加入4%多聚甲醛液，置于4 ℃冰箱固定15 min，PBS液清洗3min，重复2次。将固定好的细胞用CD133进行免疫荧光染色，荧光倒置显微镜下观察并拍照取材。

2 结 果

2.1 PDGF-C对ES-2细胞增殖的影响 如图1所示，加入PDGF-C的各组细胞其增殖能力较对照组均有明显增强，且差异有统计学意义(P<0.05)。加入PDGF-C后，ES-2细胞的增殖均在第4天达到高峰，但PDGF-C与细胞增殖之间未呈现线性浓度/效应关系，其中在PDGF-C浓度为20 μg/L时达高峰，而40 μg/L 浓度时其效应与10 μg/L 浓度时相近。

2.2 PDGF-C对ES-2细胞周期的影响 如图2所示，在不同浓度的PDGF-C刺激下，处于细胞周期G1期的ES-2细胞比例与对照组相比明显降低(P<0.05)，处于S期的ES-2细胞比例则显著升高(P<0.05)，而处于G2+M期的细胞比例则无明显变化(P>0.05)。

图1 不同浓度PDGF-C对人卵巢透明细胞癌细胞(ES-2)增殖能力的影响

2.3 PDGF-C对ES-2细胞迁移的影响 与对照组相比，加入PDGF-C的各组细胞向划痕空白处迁移的数量明显增多，并且迁移速度也明显加快；其中当PDGF-C的浓度为20 μg/L时，ES-2细胞迁移速度最快(图3)。

图2 PDGF-C对ES-2细胞周期的影响

2.4 PDGF-C对ES-2细胞的趋化作用 加入PDGF-C的ES-2细胞在Transwell培养24 h后，细胞迁移到小室底部膜的下室面，并沿着小室孔道呈现细长形生长(图4)。加入PDGF-C的实验组细胞迁移数量明显高于对照组，其中浓度为20 μg/L的PDGF-C小室膜下室面ES-2细胞数量最多，其次是浓度为40 μg/L和10 μg/L。

图3 PDGF-C对ES-2细胞迁移能力的影响

A1～A5.对照组，未添加PDGF-C；B1～B5. 添加PDGF-C浓度为10 μg/L；C1～C5. 添加PDGF-C浓度为20 μg/L；D1～D5. 添加PDGF-C浓度为40 μg/L

图4 PDGF-C对ES-2细胞的趋化作用

A.对照组，未添加PDGF-C；B. 添加PDGF-C浓度为10 μg/L；C. 添加PDGF-C浓度为20 μg/L；D. 添加PDGF-C浓度为40 μg/L

3 讨 论

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，起病隐匿，大多数患者在发现时已为晚期。其中约90%的卵巢癌来源于卵巢表面的生发上皮，称为上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)。卵巢透明细胞癌(OCCC)来源于苗勒管上皮，好发于围绝经期妇女，常合并子宫内膜异位症[10]，其发生机制尚不明确。OCCC易早期转移、早期复发，加之易发生耐药，导致其预后较差。

肿瘤的发生、进展、转移及复发受多种因素调控，肿瘤生长的微环境是其重要条件[11]。近年来，肿瘤微环境影响肿瘤的生长、侵袭、转移等生物学行为这一观念逐渐被越来越多的人所接受。肿瘤微环境由内皮细胞、基质细胞、免疫细胞、多种生长因子、细胞因子及细胞外基质等构成，通过复杂的信号通路及机制调控肿瘤的生物学特性。

PDGF是一类已被认识的生长因子，能维持正常组织和细胞生长分化，作为促进血管生成的关键生长因子，是肿瘤微环境中的重要成员，对肿瘤的发生、进展及转移具有重要作用。研究表明PDGF在多种实体肿瘤中高表达，如乳腺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌等[12,13]。PDGF家族包括PDGF-A、B、C、D等亚型，其为单体时无活性，需通过二硫键结合为二聚体时才具有生物活性被分泌出来。其中，PDGF-A和PDGF-B的研究已较为成熟，而PDGF-C和PDGF-D作为PDGF家族新成员，研究时间较短。PDGF通过结合并激活其特异性受体，激活下游信号通路，调控肿瘤的生物学行为，其作用机制尚不明确，可能与启动基因转录、增加细胞内钙离子浓度有关[14]。研究表明，PDGF-AA能诱导内皮细胞和平滑肌细胞迁移，促进肿瘤内部新生血管的形成[15]；PDGF-BB能促进细胞分裂增殖[16]；PDGF-CC能促进卵巢组织中新生血管形成；PDGF-DD能影响组织中化疗药物的吸收[17]。

PDGF-C作为新发现的PDGF家族的一员，文献报道能促进内皮细胞及平滑肌细胞分裂及迁移，从而促进肿瘤组织内新生血管形成，同时能够趋化成纤维细胞[18,19]。另外，有研究表明，PDGF-C能调控炎性细胞功能，改变肿瘤细胞所处的微环境[20]。文献报道，PDGF-C在多种上皮细胞肿瘤细胞中高表达，而基质细胞大量表达其受体，激活酪氨酸激酶通路，影响肿瘤微环境的构成[21]。综上所述，PDGF-C在肿瘤组织中通过直接或间接作用，调控肿瘤的生长、侵袭和转移。

本研究表明，PDGF-C能显著促进卵巢透明癌ES-2细胞的增殖。细胞周期检测表明，PDGF-C能诱导ES-2细胞进入分裂增殖周期，使S期细胞比例增大，说明处于活跃的DNA复制与合成期的细胞量有所增加，这也证实了PDGF-C能够促进ES-2细胞内DNA合成，加快细胞的有丝分裂及增殖。在细胞划痕实验及Transwell细胞趋化实验中可以明显看到加入PDGF-C组的细胞迁移与趋化速度要比对照组快，说明PDGF-C对ES-2细胞的迁移与趋化作用是正向调控的。比较不同浓度对ES-2细胞的迁移与趋化作用可以发现，随着PDGF-C浓度的增加，ES-2细胞的迁移与趋化速度明显加快，当到达20 μg/L时迁移与趋化速度最快，说明PDGF-C对ES-2的迁移与趋化作用不是呈线性增加的，而是存在一个最适浓度(20 μg/L接近最适浓度)。

综上所述，本研究证实，PDGF-C能直接作用于卵巢癌细胞，不但能增强肿瘤细胞的增殖能力，也能促进肿瘤细胞的迁移能力，从而提示其可能在肿瘤的浸润和转移中发挥作用。对PDGF-C的深入研究，将为卵巢癌的诊断以及治疗开辟一条崭新的道路。

[1] Rooth C. Ovarian cancer: risk factors，treatment and management [J]. Br J Nurs，2013，22 (17) : S23-30.

[2] Collins Y, Holcomb K，Chapman-Davis E，etal. Gynecologic cancer disparities: a report from the Health Disparities Taskforce of the Society of Gynecologic Oncology [J]. Gynecol Oncol，2014，133(2):353-361.

[3] Lee Y Y, Kim T J, Kim M J,etal．Prognosis of ovarian clear cell carcinoma compared toother histological subtypes: a meta-analysis [J]. Gynecol Oncol, 2011, 122(3): 541-547.

[4] SugiyamaT, KamuraT, Kigawa N,etal. Clinical characteristics of clear cell carcinoma of the ovary: a distinct histologic type with poor prognosis and resistance to platinum-based chemotherapy [J]. Cancer, 2000, 88: 2584-2589.

[5] Lai K K, Shang S, Lohia N,etal. Extracellular matrix dynamics in hepatocarcinogenesis: a comparative proteomics study of PDGFC transgenic and Pten null mouse models [J]. PLoS Genet, 2011, 7(6): e1002147.

[6] Khajah M A, Al S S, Mathew P M,etal. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells[J]. PLoS One, 2012, 7(7):e41847.

[7] Ruffini F, Tentori L, Dorio A S,etal. Platelet-derived growth factor C and calpain-3 are modulators of human melanoma cell invasiveness [J]. Oncol Rep, 2013, 30(6):2887-2896.

[8] Vera C，Tapia V，Vega M，etal．Role of nerve growth factor and its TRKA receptor in normal ovarian and epithelial ovarian cancer angio genesis [J]. J Ovarian Res，2014, 7: 82．

[9] McCormack D R，Walsh A J，Sit W，etal. In vivo hyperspectral imaging of microvessel response to trastuzumab treatment in breast cancer xenografts [J]. Biomed Opt Express，2014, 5(7) : 2247-2261．

[10] Neto J S, Kho R M, Siufi D F D S,etal. Cellular, Histologic, and Molecular Changes Associated With Endometriosis and Ovarian Cancer [J]. Journal of Minimally Invasive Gynecology, 2014, 21(1): 55～63.

[11] Sun Y. Translational horizons in the tumor microenvironment: harnessing breakthroughs and targeting cures [J]. Med Res Rev, 2015, 35(2):408-436.

[12] Frings O, Augsten M, Tobin N P,etal. Prognostic significance in breast cancer of a gene signature capturing stromal PDGF signaling [J]. Am J Pathol, 2013, 182(6): 2037-2047.

[13] Uutela M, Lauren J, Bergsten E,etal. Chromosomal location, exon structure, and vascular expression patterns of the human PDGF-C and PDGF-D genes [J]. Circulation, 2001, 103(18): 2242-2247.

[14] Savikko J, Teppo A M, Taskinen E,etal. Different effects of tacrolimus and cyclosporine on PDGF induction and chronic allograft injury: evidence for improved kidney graft outcome [J]. Transpl Immunol, 2014, 31(3): 145-151.

[15] Demaria M, Ohtani N, Youssef S A,etal. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA [J]. Dev Cell, 2014, 31(6): 722-733.

[16] Guo J, Li L, Wu Y J,etal. Inhibitory effects of Brazilin on the vascular smooth muscle cell proliferation and migration induced by PDGF-BB [J]. Am J Chin Med, 2013, 41(6): 1283-1296.

[17] Bonner J C. Regulation of PDGF and its receptors in fibrotic diseases [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2004, 15(4): 255-273.

[18] Martin I V, Borkham-Kamphorst E, Zok S,etal. Platelet-derived growth factor (PDGF)-C neutralization reveals differential roles of PDGF receptors in liver and kidney fibrosis [J]. Am J Pathol, 2013, 182(1): 107-117.

[19] Grun K, Markova B, Bohmer F D,etal. Elevated expression of PDGF-C in coxsackievirus B3-induced chronic myocarditis [J]. Eur Heart J, 2005, 26(7): 728-739.

[20] Li R, Maminishkis A, Wang F E,etal. PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007, 48(12): 5722-5732.

[21] Campbell J S, Hughes S D, Gilbertson D G,etal. Platelet-derived growth factor C induces liver fibrosis, steatosis, and hepatocellular carcinoma [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(9): 3389-3394.

(2016-08-04收稿 2016-09-25修回)

(责任编辑 武建虎)

Effect of platelet-derived growth factor-C on proliferation and migration of ovarian cancer cells in vitro

LI Xiaoying1, GUO Ximin2,GUO Hongyan2, and PAN Lingya1.

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100730，China；2.Department of Advanced Interdisciplinary Studies, Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China；3.Department of Dentistry，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To examine the effect of platelet-derived growth factor-C (PDGF-C) on ovarian clear cell carcinoma cells ES-2 in vitro.Methods ES-2 cells were cultured with the supplement of different concentrations of PDGF-C (0, 10, 20 and 40 μg/L). CCK8 assay was used to detect the effect of PDGF-C on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell cycle phases. Transwell assay and cell scratch test were used to detect cell migration ability.Results PDGF-C could not only significantly induce proliferation of ES-2 compared with the blank control group without PDGF-C, but increase the percentage of the cells in S phase. Additionally, it was found the best concentration of PDGF-C to promote the proliferation of ES-2 cells was 20 μg/L. With the stimulation of different concentrations of PDGF-C, the proportion of ES-2 cells in G1 and S cell cycle was significantly decreased (P<0.05) and significantly increased (P<0.05) respectively, while the proportion of cells in G2+ M phase did not change compared with the control group (P>0.05). At the same time, PDGF-C increased the migration ability of ES-2 cells.Conclusions PDGF-C can promote the proliferation and migration of ES-2 cells in vitro.

platelet-derived growth factor-C; ES-2; cell proliferation; cell migration

国家自然科学基金(81172481)

李晓莹，博士研究生。

1.100730，中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院妇产科；2.100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所；3.100039 北京，武警总医院口腔科

潘凌亚，E-mail: lingyapan@hotmail.com

R711.15