宫颈鳞癌组织中跨膜受体蛋白Notch3的表达变化及其意义

高薇薇，张青，冯佳，黄芳，王伟，张曙

(南通大学附属医院，江苏南通226001)

宫颈鳞癌组织中跨膜受体蛋白Notch3的表达变化及其意义

高薇薇，张青，冯佳，黄芳，王伟，张曙

(南通大学附属医院，江苏南通226001)

目的 观察宫颈鳞癌组织中跨膜受体蛋白Notch3的表达变化，并探讨其意义。方法 收集宫颈鳞癌组织石蜡标本及其对应的正常宫颈组织石蜡标本各116例、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ+Ⅱ级病灶石蜡标本53例及CINⅢ级病灶石蜡标本41例，采用免疫组化法检测各标本中的Notch3，分析Notch3表达与宫颈鳞癌临床病理参数及预后的关系。结果 宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织、CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织中Notch3的阳性表达率分别为52.6%、21.6%、43.9%和41.5%，宫颈鳞癌组织中Notch3的阳性表达率高于正常宫颈组织、CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织，CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织中Notch3的阳性表达率高于正常宫颈组织(P均<0.01)。Notch3表达与宫颈鳞癌肌层浸润深度、组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。Notch3表达阳性者和Notch3表达阴性者中位生存期分别为43、62.3个月，两者相比，P<0.05。Notch3表达阳性者1年生存率为93.4%、3年生存率为60.7%、5年生存率为31.1%，Notch3表达阴性者分别为98.2%、83.6%、60.0%，二者1、3、5年生存率相比，P均<0.05。结论 宫颈鳞癌组织中Notch3阳性表达率升高，Notch3表达与肿瘤肌层浸润深度、组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移及预后有关，Notch3可能参与了宫颈鳞癌的发生及发展。

宫颈癌；宫颈鳞癌；跨膜受体蛋白；Notch3；Notch信号通路；宫颈上皮内瘤变

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来呈现发病年轻化趋势。鳞癌是宫颈癌最常见的组织学类型[1]。早期宫颈鳞癌患者预后较好，手术治疗、放化疗、免疫治疗及中医药治疗等方式有助于延长患者生命，故宫颈鳞癌的早期诊断意义重大[2]。跨膜受体蛋白Notch信号通路在肿瘤发生过程中的作用是近年研究的热点，现已证实Notch信号通路参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化等过程[3]。Notch3是Notch受体家族的重要成员，广泛存在于多种组织细胞中。本研究观察了宫颈鳞癌组织中Notch3的表达变化，探讨Notch3与宫颈鳞癌发生、发展的关系及与宫颈鳞癌患者预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 宫颈鳞癌组织标本及其来源 收集南通大学附属医院病理科2009年1月～2010年12月获取并留存的宫颈鳞癌组织石蜡标本及其对应的正常宫颈组织石蜡标本各116例，宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ+Ⅱ级病灶石蜡标本53例及CIN Ⅲ级病灶石蜡标本41例。宫颈鳞癌标本来源病例均为原发病例，术前未经过放化疗、免疫治疗或中药治疗。宫颈鳞癌患者年龄27～74岁，年龄<46岁61例、≥46岁55例；97例患者术后采取单纯放疗、放化疗联合治疗、免疫治疗或中药治疗，19例患者术后未采取辅助治疗。CIN Ⅰ+Ⅱ级患者年龄26～69岁，<49岁31例、≥49岁22例。CIN Ⅲ级患者年龄29～77岁，<47岁19例、≥47岁22例。所有病例均具有完整的临床病理资料，随访日期截止至2015年12月31日，所有患者均获得随访。

1.2 宫颈鳞癌组织中Notch3的检测 采用免疫组化EnVision法，所有标本经4%甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，5 μm连续切片；切片经70 ℃烘烤45 min，二甲苯脱蜡，柠檬酸修复液(pH 6.0)高温高压修复20 min，30%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，滴加一抗(兔抗人Notch3多克隆抗体，1∶200)，冰箱内4 ℃过夜，滴加二抗；DAB显色，复染，0.1%盐酸酒精分化，脱水，封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性切片作为阳性对照。Notch3可定位于细胞质、细胞膜和细胞核，阳性染色表现为细胞核出现黄色至棕黄色细小颗粒。在每张切片选取具有代表意义的5个高倍视野，每个视野计数250个细胞。根据阳性细胞百分比和染色强度综合判定结果：阳性细胞百分比<5%计0分，5%～<25%计1分，25%～<50%计2分，50%～<75%计3分，≥75%计4分；染色强度为浅黄色或无色计0分，黄色计1分，深棕色计2分，棕褐色计3分；上述两项得分乘积为0～6判定为Notch3无或低表达(即阴性)，7～12判定为Notch3高表达(即阳性)。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。做Kaplan-Meier生存曲线进行预后分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌组织中Notch3的表达变化 宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织、CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织中Notch3的阳性表达率分别为52.6%(61/116)、21.6%(25/116)、43.9%(18/41)和41.5%(22/53)，宫颈鳞癌组织中Notch3的阳性表达率高于正常宫颈组织、CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织，CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织中Notch3的阳性表达率高于正常宫颈组织(P均<0.01)。

2.2 Notch3表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系 Notch3表达与宫颈鳞癌肌层浸润深度、组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者年龄、肿瘤最大径无关(P均>0.05)。见表1。

表1 Notch3表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系

2.3 Notch3表达与宫颈鳞癌预后的关系 Notch3表达阳性者中位生存期为43个月，Notch3表达阴性者中位生存期为62.3个月，两者相比，P<0.05。Notch3表达阳性者1年生存率为93.4%、3年生存率为60.7%、5年生存率为31.1%，Notch3表达阴性者分别为98.2%、83.6%、60.0%，二者1、3、5年生存率相比，P均<0.05(见图1)。

图1 Notch3表达与宫颈鳞癌患者生存时间的关系

3 讨论

宫颈鳞癌的发生是多种因素、多基因参与的过程，宫颈鳞癌预后影响因素很多，治疗效果并不十分理想[4]。因此，寻找宫颈鳞癌的特异性治疗靶点意义重大。Notch信号通路是近年讨论的热点。Notch信号通路是哺乳动物进化过程中高度保守的信号通路，在胚胎发育过程中，Notch受体与配体结合后可发生活化，活化的Notch受体直接转移至细胞核内，与转录调控因子结合，激活靶基因，此过程不依赖第二信使的信号通路发挥作用，具有自身特殊性。但由于Notch信号通路中含有多个受体与配体，激活Notch同时可激活其他多种信号通路[5,6]。Notch信号通路在肿瘤及神经退行性变发病、免疫功能调控、胚胎发育、血管生成等病理生理过程中起着重要作用[7,8]。由Notch基因编码的Notch受体在细胞分化进程中起整体协调作用，在细胞发育成熟后则呈现低水平表达。在哺乳动物体内，Notch受体是在细胞表面表达的Ⅰ型跨膜蛋白，主要含有Notch1、2、3、4四个亚型。其中，Notch3最早在增生的神经上皮细胞中被发现，19号染色体易位往往会导致Notch3过表达。Notch3与Notch家族其他成员存在高度相似性，但在结构上有所差异，主要是其胞内段的转录激活区(TAD)较其他成员明显缩短，因此，Notch3的转录激活性能相对较弱[3]。

目前，多项研究[9～11]发现Notch3涉及人类多种实体肿瘤的生成过程，如非小细胞肺癌(NSCLC)、食管鳞癌、急性T淋巴细胞白血病、卵巢浆液性癌等。研究[12,13]发现Notch1能诱导HIF-1表达，调节VEGF表达，促进肿瘤血管生成，促进NSCLC的侵袭和转移。Ohashi等[14～16]的研究结果显示，特异性阻断Notch3表达后NSCLC细胞增殖受到明显限制，推测机制是肿瘤细胞对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的敏感性增强，减少肿瘤细胞中MAPK磷酸化水平，从而抑制肿瘤细胞增殖。Liu等[17]发现食管鳞癌细胞中Notch3呈高表达，Notch3参与诱导鳞状细胞分化和浸润性生长。学者们在关于急性T淋巴细胞白血病的研究[18]和关于卵巢浆液性癌的研究[19]中也得出了类似结论。还有研究[20,21]发现，在卵巢癌细胞株OVCA429中，激活Notch3能激活Slug、Snail信号通路，降低E-钙黏蛋白表达，促进上皮间质转化。我们推测在宫颈鳞癌组织中的Notch3阳性率可能同样增加，Notch3表达与宫颈鳞癌患者的预后可能存在一定关联。

本研究分别检测了宫颈鳞癌、CIN Ⅰ+Ⅱ级病灶、CIN Ⅲ级病灶及正常宫颈组织中的Notch3，结果显示，宫颈鳞癌组织中Notch3的阳性表达率高于正常宫颈组织、CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织，CIN Ⅲ级组织及CIN Ⅰ+Ⅱ级组织中Notch3的阳性表达率高于正常宫颈组织，Notch3表达与宫颈鳞癌肌层浸润深度、组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关，提示Notch3可能参与了宫颈鳞癌的发生、发展。进一步分析显示，Notch3表达阳性者中位生存期短于Notch3表达阴性者，Notch3表达阳性者1、3、5年生存率小于Notch3表达阴性者，提示Notch3的表达预示着宫颈鳞癌患者预后不良，可能是由于Notch3促进了上皮向间质转化，具体机制待进一步证实。

尽管已有许多研究对宫颈鳞癌的发病机制进行阐述，但仍未有重大突破。结合本研究结果，我们认为，Notch3可能有癌基因的性质，其高表达与宫颈鳞癌的发生、进展密切相关，Notch3有望作为宫颈鳞癌潜在的治疗靶点。

[1] 张国楠.重视子宫颈癌嗜神经侵袭的基础与临床病理研究[J].中华妇产科杂志,2015,50(12):923-925.

[2] Sadalla JC, Andrade JM, Genta ML, et al. Cervical cancer: what′s new[J]. Rev Assoc Med Bras(1992), 2015,61(6):536-542.

[3] Chitnis A, Balle-Cuif L. The Notch meeting: an odyssey from structure to function[J]. Development, 2016,143(4):547-553.

[4] Rechberger T, Perzylo K, Miotla P, et al. Carcinoma of the cervical stump--multicenter study[J]. Ginekol Pol, 2014,85(6):435-440.

[5] Sun JJ, Wang ZY, Li LS,et al. Prevention against diffuse spinal cord astrocytoma: can the Notch pathway be a novel treatment target[J]. Neural Regen Res,2015,10(2):244-251.

[6] Mori M, Mahoney JE, Stupnikov MR, et al. Notch3-Jagged signaling controls the pool of undifferentiated airway progenitors[J]. Development, 2015,142(2):258-267.

[7] Pakkiriswami S, Couto A, Nagarajan U, et al. Glycosylated Notch and Cancer[J]. Front Oncol, 2016(6):37.

[8] Rutten-Jacobs LC, Traylor M, Adib-Samii P, et al. Common NOTCH3 Variants and Cerebral Small-Vessel Disease[J]. Stroke, 2015,46(6):1482-1487.

[9] Gripp KW, Robbins KM, Sobreira NL, et al. Truncating mutations in the last exon of NOTCH3 cause lateral meningocele syndrome[J]. Am J Med Genet A , 2015,167(2):271-281.

[10] Zhu Y, Wang J, Wu Y, et al. Two novel mutations in NOTCH3 gene causes cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcritical infarct and leucoencephalopathy in two Chinese families[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(2):1321-1327.

[11] Jamal M, Chogle SM, Karam SM, et al. NOTCH3 is expressed in human apical papilla and in subpopulations of stem cells isolated from the tissue[J]. Genes Dis, 2015,2(3):261-267.

[12] 姜昕,周建华,邓征浩,等.Notch1, Jagged1和VEGF蛋白在非小细胞肺癌的表达及其意义[J].中南大学学报(医学版),2007,32(6):1031-1036.

[13] Cheng Z, Tan Q, Tan W, et al. Cigarette smoke induces the expression of Notch3, not Notch1, protein in lung adenocarcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,10(2):641-646.

[14] Ohashi S, Natsuizaka M, Yashiro-Ohtani Y, et al. NOTCH1 and NOTCH3 coordinate esophageal squamous differentiation through a CSL-dependent transcriptional network[J]. Gastroenterology, 2010,139(6):2113-2123.

[15] Arasada RR, Amann JM, Rahman MA, et al. EGFR blockade enriches for lung cancer stem-like cells through Notch3-dependent signaling[J]. Cancer Res, 2014,74(19):5572-5584.

[16] Ye YZ, Zhang ZH, Fan XY, et al. Notch3 overexpression associates with poor prognosis in human non-small-cell lung cancer[J]. Med Oncol, 2013,30(2):595.

[17] Liu J, Fan H, Ma Y, et al. Notch1 is a 5-fluorouracil resistant and poor survival marker in human esophagus squamous cell carcinomas[J]. PLoS One, 2013,8(2):e56141.

[18] Indraccolo S, Minuzzo S, Masiero M, et al. Cross-talk between tumor and endothelial cells involving the Notch3-Dll4 interaction marks escape from tumor dormancy[J]. Cancer Res, 2009,69(4):1314-1323.

[19] Park JT, Li M, Nakayama K, et al. Notch3 gene amplification in ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2006,66(12):6312-6318.

[20] Gupta N, Xu Z, El-Sehemy A, et al. Notch3 induces epithelial-mesenchymal transition and attenuates carboplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2013,130(1):200-206.

[21] Ohashi S, Natsuizaka M, Naganuma S, et al. A NOTCH3-mediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors[J]. Cancer Res, 2011,71(21):6836-6847.

张曙(E-mail: tdfyzs@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.022

R737.33

B

1002-266X(2017)03-0070-03

2016-08-12)