SENP1基因沉默的人Ⅱ型肺泡上皮细胞系构建

赵许，董文斌，雷小平，李清平，康兰，赵帅，张婵

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

SENP1基因沉默的人Ⅱ型肺泡上皮细胞系构建

赵许，董文斌，雷小平，李清平，康兰，赵帅，张婵

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

目的 构建稳定沉默SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)基因的人Ⅱ型肺泡上皮细胞系HEPApiC。方法 构建沉默SENP1基因的LV3-SENP1-RNAi慢病毒载体。将HEPApiC细胞分为实验组、对照组、空载组，实验组感染LV3-SENP1-RNAi，空载组感染空载体，对照组不做特殊处理；感染72 h后观察绿色荧光强度，采用qRT-PCR检测HEPApiC细胞中的SENP1 mRNA，采用Western blotting法检测SENP1蛋白。结果 经酶切鉴定及测序分析，成功构建LV3-SENP1-RNAi慢病毒载体质粒，包装后得到高滴度的病毒颗粒。感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC细胞中GFP表达随时间延长逐渐增强，说明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC细胞。实验组、对照组、空载组细胞中SENP1 mRNA相对表达量分别为0.026、0.050、0.057，SENP1蛋白相对表达量分别为0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008；实验组SENP1 mRNA及蛋白相对表达量降低，与对照组及空载组相比，P均<0.05。结论 成功构建了稳定沉默SENP1基因的HEPApiC细胞系。

小泛素相关修饰蛋白质类；人Ⅱ型肺泡上皮细胞；基因沉默；RNA干扰

随着新生儿复苏技术的提高，早产儿存活率也显著上升，这与呼吸机的使用有很大关系。研究[1]发现，氧化应激反应是新生儿高氧肺损伤的重要发病机制之一，而呼吸机等新型医疗技术的应用增加了新生儿尤其是早产儿氧暴露的风险。高氧使患儿体内活性氧簇(ROS)生成增多，SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)被激活，沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的734位赖氨酸去SUMO化，减少SIRT1去乙酰化，激活细胞凋亡蛋白p53，进而诱导细胞凋亡[2]；而SIRT1可降低ROS水平，促进p53去乙酰化，抑制细胞凋亡[3]。因此推测SENP1可能通过SIRT1调节机体ROS水平，参与高氧肺损伤的发病过程。为进一步研究SENP1的功能及其在高氧肺损伤氧化应激反应中的作用机制，我们构建了稳定沉默SENP1基因的人Ⅱ型肺泡上皮细胞系HEPApiC，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与主要材料 HEPApiC细胞由西南医科大学附属医院中心实验室保存，HEK293T细胞由上海中科院细胞库提供，HEPApiC细胞及HEK293T细胞培养于配制好的培养液中，在37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度条件下培养。DMEM高糖培养基，胎牛血清；引物，DEPC，RT试剂，荧光定量PCR试剂，Sybr green Ⅰ，ECL增强化学发光检测试剂盒，PrimeSTARTMHS DNA聚合酶，胶回收试剂盒，质粒小量抽提试剂盒，DNase Ⅰ(RNase-free)，Ex TaqTMR-PCR ver.2.1，AMV Reverase Transcriptase，BamH Ⅰ，NOtI EcoRI，T4 DNA ligase buffer，NucleoBond Xtra Midi Plus；制备感受态试剂盒，SENP1一抗(兔来源)，内参GAPDH一抗(兔来源)，羊抗兔IgG二抗。

1.2 LV3-SENP1-RNAi的构建及包装 在GenBank查得SENP1(NM_29843)序列，依据RNA干扰(RNAi)原则设计三条引物，即ATF3-Mus-356、ATF3-Mus-546、ATF3-Mus-736，根据沉默效果选取ATF3-Mus-356作为靶序列并扩增，经EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切得到线性LV3，经纯化、T4 DNA连接酶定向连接，将得到的表达载体转化感受态细胞，PCR法及酶切法鉴定阳性克隆，对其进行测序和序列比对分析以验证LV3-SENP1-RNAi的构建情况。利用质粒系统(LV3，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV，PG-P3-RRE)对LV3-SENP 1-RNAi进行慢病毒包装(其中LV3慢病毒穿梭质粒能表达GFP)，制备慢病毒颗粒。分别抽提上述四种质粒，共转染常规培养的HEK293T细胞：转染前1 d取状态良好的对数期HEK293T细胞，胰蛋白酶消化，按2×106/皿接种，在37 ℃、50 mL/L CO2培养箱内培养；当细胞密度达60%～70%时，加入混合液(含质粒及磷酸钙)，8 h后更换新鲜培养液，72 h后收集细胞上清液，4 000 r/min离心10 min后收集病毒上清液，0.45 μm滤器过滤，4 ℃、25 000 r/min离心2 h，而后以预冷的500 μL的DMEM重悬病毒沉淀，4 ℃溶解过夜。采用倍比稀释法测定病毒滴度。

1.3 LV3-SENP1-RNAi感染HEPApiC细胞 取生长状况良好的HEPApiC细胞，胰蛋白酶消化吹打成单细胞悬液，以(3～5)×104/孔的密度接种于24孔培养板，每孔加入100 μL培养基，培养24 h。铺板时细胞融合率约50%，待融合率达70%且细胞状态良好时开始后续试验。将HEPApiC细胞分为两组，实验组按30个感染复数(MOI)/孔感染重组慢病毒颗粒，空载组按20 MOI/孔感染空载体。24 h后更换培养液继续培养。96 h后在倒置荧光显微镜下观察GFP荧光，计算感染效率。

1.4 SENP1基因沉默的HEPApiC细胞的构建及验证 将HEPApiC细胞分为实验组、对照组、空载组。实验组及空载组依照“1.3”方法进行感染，对照组为未感染细胞。三组细胞均置于37 ℃、 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱中进行培养，24 h后更换培养液。

1.4.1 SENP1 mRNA检测 采用qRT-PCR法。按照说明书方法，感染72 h后提取细胞总mRNA，通过反转录反应体系生成cDNA，经过SYBR green Ⅰ荧光染料反应着色后用PCR仪进行检测。SENP1基因上游引物序列为5′-CCAGCATTTTAACTAACCAGGAAC-3′，下游引物序列为5′-GCTAAGTTATCTGGCTGATGTGG-3′；GAPDH上游引物序列为5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物序列为5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。PCR扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循环35次，72 ℃检测信号。检测完毕得出Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.4.2 SENP1蛋白检测 采用Western blotting法。感染72 h后收集三组细胞，提取总蛋白，稀释方法同BSA标准品溶液，在酶标仪562 nm波长处测定吸光度值，依据BSA标准溶液吸光度值减Blank值的平均值绘制标准曲线，将各样品溶液的吸光度值减Blank值的平均值带入标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。蛋白上样，经聚丙烯氨酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE分离蛋白质，封闭液封闭，一抗孵育，二抗孵育，洗涤，曝光后分析目的条带的灰度值，以经内参校正后的灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LV3-SENP1-RNAi的构建及鉴定情况 慢病毒表达载体的酶切鉴定结果与预期相符，说明目的基因成功插入载体，测序结果正确(图1)，LV3-SENP1-RNAi慢病毒表达载体构建成功。显微镜下见转染慢病毒载体后的HEK293T细胞发出绿色荧光。经逐孔稀释滴度测定法测定LV3-SENP1-RNAi病毒滴度为9×108TU/mL，LV3-GFP病毒滴度为3×108TU/mL。

图1 重组质粒测序结果

2.2 LV3-SENP1-RNAi感染HEPApiC细胞情况 观察HEPApiC细胞中GFP表达情况(见图2)，发现感染LV3-SENP1-RNAi的细胞中GFP表达随时间延长逐渐增强，96 h后荧光达到最强，说明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC细胞。

注：A、B分别为感染空载体细胞的可见光、荧光图像，C、D分别为感染LV3-SENP1-RNAi细胞的可见光、荧光图像。

图2 感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC细胞中GFP表达情况

2.3 SENP1基因沉默HEPApiC细胞的构建及验证情况 实验组、对照组、空载组细胞中SENP1 mRNA相对表达量分别为0.026、0.050、0.057，SENP1蛋白相对表达量分别为0.161±0.015、0.781±0.046、0.811±0.008；实验组SENP1 mRNA及蛋白相对表达量降低，与对照组及空载组相比，P均<0.05，表明感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC细胞SENP1 mRNA及蛋白敲减成功，建立了稳定沉默SENP1基因的HEPApiC细胞系。

3 讨论

氧化应激是细胞发生损伤、凋亡最常见的原因之一。当机体遭受各种有害刺激时，体内ROS产生过多或过快均会影响机体内氧化系统和抗氧化系统的平衡，当氧化系统占据主导地位时，极易发生组织损伤。目前，吸入高体积分数氧(高氧)是新生儿尤其是早产儿救治的重要手段，但高氧会诱导机体产生大量ROS。早产儿发育不成熟，对ROS的清除能力不足，高氧吸入治疗早期即有可能发生急性肺损伤，一旦治疗不及时或不当，将会大大增加支气管、肺发育不良的发生率[4，5]。沉默接合型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)是一类高度保守的依赖烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第3类组蛋白去乙酰化酶[6]，能介导细胞分化、凋亡、衰老，影响信号转导、氧化应激、转录调节等重要生理过程，且在定位于细胞核才能发挥相应作用[7，8]。前期研究[9～11]显示SIRT1参与了早产儿高氧诱导的氧化应激反应，了解SIRT1的功能及其上下游基因在氧化应激中发挥的作用十分必要。SENP1作为SIRT1的特异性去SUMO化酶，能通过对SIRT1的去SUMO修饰影响其在细胞核内外的分布，从而影响SIRT1的功能及其对下游基因的调控。因此我们认为，如果能够在氧化应激发生早期下调SENP1表达，有望抑制其对SIRT1的去SUMO化作用，抑制p53的活性，减少细胞凋亡。

研究发现，蛋白质的翻译后修饰(靶蛋白上特定氨基酸磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化等)是蛋白质发挥生物学功能的重要调节机制之一[12]。SUMO修饰是其中非常重要的一种，主要通过与靶蛋白共价连接发挥相应的修饰作用[13]。SENPs家族在SUMO化修饰与去SUMO化修饰之间发挥杠杆作用[14]。作为SENPs家族重要成员之一，SENP1同样具有这种作用。SENP1可水解SUMO蛋白暴露其C端甘氨酸残基，为SUMO与底物蛋白赖氨酸结合位点结合并修饰靶蛋白提供基础；也可切断SUMO与底物蛋白间的异肽键，实现去SUMO化过程[13]。目前学者们无法肯定SENP1是通过何种机制影响SIRT1的分布与功能，干扰SENP1基因表达能为二者间关系的研究提供参考。现已发现，在高氧条件下，SENP1蛋白表达减少，SIRT1表达也发生相应改变，说明二者之间可能存在联系，并且均与氧化应激有关。

我们借助RNAi技术制备了三条SIRT1基因的干扰引物，选取ATF3-Mus-356作为靶序列并扩增。RNAi主要通过将外源性或内源性双链RNA导入细胞，特异性降解与该段RNA同源的mRNA，继而降低靶蛋白表达[15]。研究发现，相比致癌病毒，慢病毒虽然具有更复杂的复制周期、含有更复杂的基因组，但它们能感染非分裂细胞和分化末端的细胞。本研究成功构建LV3-SENP1-RNAi慢病毒载体质粒，将包装好的病毒颗粒成功感染HEPApiC细胞，在荧光显微镜下，能通过载体上携带的GFP表达情况评价感染效率。本研究结果显示，感染LV3-SENP1-RNAi的HEPApiC细胞中GFP表达随时间延长逐渐增强，说明LV3-SENP1-RNAi成功感染HEPApiC细胞。进一步通过qRT-PCR与Western blotting检测验证显示，实验组SENP1 mRNA及蛋白相对表达量低于对照组及空载组，说明稳定沉默SENP1基因的HEPApiC细胞系构建成功。上述结果为进一步研究SENP1基因在新生儿高氧肺损伤发生中的具体作用机制奠定了实验基础。

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摘自《中国学术期刊(光盘版)检索与评价数据规范》(修订版CAJ-CD B/T 1-2006)

Establishment of HEPApiCs cell line stably silencing SENP1

ZHAOXu,DONGWenbin,LEIXiaoping,LIQingping,KANGLan,ZHAOShuai,ZHANGChan

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To establish human type II alveolar epithelial cells (HEPApiC) that can stably silence SUMO specific protease 1 (SENP 1) . Methods We constructed the LV3-SENP1-RNAi lentiviral vector silencing SENP1 gene.HEPApiC cells were divided into the experimental group, control group and empty vector group. The experimental group was infected with LV3-SENP1-RNAi, the empty vector group with empty vector and the control group was not treated. After 72-hour infection, the green fluorescence intensity was observed, the SENP1 mRNA in HEPApiC cells was detected by qRT-PCR, and SENP1 protein was detected by Western blotting.Results After restriction enzyme digestion and sequencing, the LV3-SENP 1-RNAi lentiviral vector plasmid was successfully constructed and we got a virion with a high titer. The expression of GFP in HEPApiC cells infected with LV3-SENP1-RNAi was gradually increased with time, indicating that LV3-SENP1-RNAi successfully infected HEPApiC cells. The relative expression of SENP1 mRNA in the experimental group, the control group and the empty vector group was 0.026, 0.050, and 0.057; and the relative expression of SENP1 protein was 0.161±0.015, 0.781±0.046 and 0.811±0.008, respectively. The expression of SENP1 mRNA and protein in the experimental group was lower than that in the control group and empty vector group, allP<0.05.Conclusion HEPApiCs cell line stably silencing SENP1 is successfully established.

small ubiquitin-related modifier proteins; human typeⅡalveolar epithelial cells; gene silencing; RNA interference

国家自然科学基金资助项目(81571480)；四川省科技厅科研项目(2014NZ0014)；泸州市政府-泸州医学院联合专项资金资助项目(2013LZLY-J08)。

赵许(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为新生儿疾病。E-mail: linda1990xu@sina.com

董文斌(1967-)，男，教授，硕士生导师，主要研究方向为新生儿疾病。E-mail: dongwenbin2000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.005

R722.19

A

1002-266X(2017)03-0016-04

2016-06-30)

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