非小细胞肺癌患者DC-CIK过继免疫治疗前后外周血TLR4表达的变化

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）过继免疫治疗前后非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血单个核细胞（PBMC）Toll样受体4（TLR4）mRNA表达变化,及脂多糖刺激下PBMC分泌细胞因子的变化,探讨TLR4在DC-CIK过继免疫治疗中的作用。方法对50例采用DC-CIK治疗的NSCLC患者，运用RT-PCR检测治疗前后PBMC TLR4mRNA表达变化，ELISA法检测治疗前后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下细胞因子（IL-6、IL-8及TNF-α）分泌的变化。结果 DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA的表达水平较治疗前显著降低（t=6.272，P＜0.01）；脂多糖刺激下PBMC分泌IL-6（t=17.407，P＜0.01）、IL-8（t=15.244，P＜0.01）及TNF-α（t=12.428，P＜0.01）显著减少。结论 DC-CIK过继免疫治疗可能通过降低PBMC TLR4mRNA的表达，提高机体抗肿瘤免疫功能。

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数的85%，5年生存率仅为15%。目前对于NSCLC的治疗除了手术、放疗、化疗等传统手段外，又出现了靶向治疗、免疫治疗等新兴疗法。其中，DC-CIK细胞疗法是过继细胞免疫治疗的首选方案[2]。研究表明，DC-CIK细胞治疗能显著提高NSCLC患者的生存期[3]。Toll样受体4（TLR4）是连接固有免疫及适应性免疫的重要桥梁，表达于多种免疫细胞[4]。本研究将通过比较NSCLC患者DC-CIK治疗前后外周血单个核细胞（PBMC）TLR4mRNA表达及功能变化，探讨TLR4在过继细胞免疫治疗中的作用机制及地位，为NSCLC的DC-CIK的治疗提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 2012年6月至2014年6月，武警浙江总队嘉兴医院胸心外科就诊并经病理检查确诊的NSCLC患者50例，均行DC-CIK治疗。50例NSCLC患者中，男31例，女19例，年龄38～78（62.24±8.62）岁。肺腺癌22例，鳞状细胞癌28例。高分化癌11例，中低分化癌39例。有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者19例。吸烟36例，不吸烟14例；TNM分期根据2009年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期11例，无Ⅳ期患者。患者均接受过肺癌的规范化治疗（包括手术治疗及放、化疗等）；血常规正常，心、肝、肾功能可耐受生物治疗；Karnofsky功能状态评分（KPS评分）＞60分；末次治疗至开始接受DC-CIK细胞免疫治疗的间隔时间≥4周；手术患者切口完全愈合；无感染、其他恶性肿瘤及传染性疾病；对生物制品无过敏。

1.2 主要试剂淋巴细胞分离液购自北京赛驰生物科技有限公司；肿瘤细胞株购自金斯瑞生物科技有限公司；重组人IFN-γ、IL-2、GM-CSF、IL-4、TNF-α均购自上海高创化学科技有限公司；抗人CD3单抗购自北京思科达生物科技有限公司；胎牛血清为美国Hyclone公司产品，RPMI-1640培养基为美国Gibco产品。总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及DNA ladder均购自TAKARA公司；TaqDNA聚合酶，dNTP均购自天为时代公司；TLR4（622 bp）引物：5′-CTGCAATGGATCAAGGACCA-3，5′-TCCCACTCCAGGTAAGTGTT-3′；βactin（374 bp）引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC-3′，5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。人IL-6、IL-8及TNF-α双抗夹心Elisa检测试剂盒购自上海巧伊生物科技有限公司。

1.3.1 抗原制备方法根据患者肿瘤类型选择相同病理的肿瘤细胞株制备抗原。取对数生长期的细胞株细胞，加入0.9%氯化钠溶液调细胞数至5×106/ml，反复冻融（-196～37℃）12次。细胞裂解物经12 000r/min离心5min，取上清液备用。

1.3.2 DC-CIK细胞制备诱导方法无菌抽取患者外周血50ml，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，加入适量RPMI-1640培养液，调整细胞浓度至2×106/ml，加入培养瓶中，置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育2h。吸出未贴壁细胞，经离心洗涤后以PRMI-1640培养液重悬（密度2×106/ml），接种于培养瓶，加入重组人IFN-γ 100μg/L及重组人IL-2 500kU/L，第2天加入抗人CD3单抗50μg/L,保持细胞密度（1～2）×106/ml，于第10～11天收集多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。在剩下的贴壁细胞中加入含重组人GM-CSF（100μg/ L）、重组人IL-4（50μg/L）的RPMI-1640培养基，于37℃，5%CO2的培养箱培养。每3d换液1次，于培养的第5天加入肿瘤裂解物（40μg/ml），于第6天加入重组人TNF-α（500U/ml），培养至第7天即获得抗原致敏的树突状细胞（DC细胞）。将DC及CIK细胞以1∶20比例混合，用含重组人IL-2（250kU/L）的RPMI-1640培养液培养4d，即为DC-CIK细胞。

1.3.3 DC-CIK治疗方案将经鉴定和质检合格（细菌、真菌培养阴性，细胞活性＞95%）的DC-CIK细胞制成含1%白蛋白及0.9%氯化钠溶液的细胞混悬液，分4次经静脉回输，每疗程回输细胞总数为（5～10）×109个。

1.3.4 RT-PCR检测PBMC TLR4mRNA表达于DCCIK治疗前1d及治疗后第10天，无菌条件下分别取患者外周血5ml，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，进行紫外定量，并鉴定RNA的质量。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。25μlPCR体系，β-actin为内参。扩增参数：94℃5min；再以94℃40s、50℃40s、72℃90s为1循环，共30个循环；72℃5min。PCR产物在含有goldview的1.5%琼脂糖凝胶上95V恒压电泳35min，最后置于凝胶成像分析仪观察结果，TLR4 mRNA和β-actin均能扩增成功。

1.3.5 ELISA检测脂多糖诱导外周血PBMC释放细胞因子于DC-CIK治疗前1d及治疗后第10天，无菌条件下分别取患者外周血5ml，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。加入适量含脂多糖（1μg/ml）的RPMI-1640培养液，调整细胞浓度至1×106/ml，加入培养瓶中，置于37℃，5%CO2浓度的培养箱中孵培养24h。取上述细胞悬液，4℃，3 000r/min离心3min，收集上清液。根据ELISA试剂盒说明书检测上清液中IL-6,IL-8,TNF-α水平。

1.3.6 计算机图像处理 RT-PCR用bandscan4.3，对每个目的条带进行总光密度值的分析，以目的产物条带与β-actin产物条带的OD值的比值代表目的基因mRNA表达的相对水平。

1.4 统计学处理采用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示，治疗前后比较采用配对t检验。

2 结果

由图1可见，DC-CIK治疗后NSCLC患者外周血PBMC TLR4mRNA的表达量（0.43±0.15）低于治疗前的表达量（0.60±0.12），差异具有统计学意义（t=6.272，P＜0.01）。

由表1可见，DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下IL-6、IL-8及TNF-α分泌显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

大量研究表明，恶性肿瘤患者免疫系统（尤其是细胞免疫系统）表现出明显功能障碍，主要包括CD3+CD4+T细胞减少，CD3+CD8+T细胞增多，CD4+/CD8+比例降低，以及NK细胞活性降低[5]，肿瘤患者外周血中有功能的成熟DC细胞数量显著减少，未成熟DC细胞数量聚集[6]。过继细胞免疫治疗能提高患者免疫力，达到治疗和预防肿瘤复发的目的。

CIK细胞是人外周血PBMC加入各种细胞因子共刺激后得到的一群异质细胞，主要效应细胞既表达T细胞标记CD3，又表达NK细胞标记CD56，对肿瘤细胞具有非主要组织相容性复合体（MHC）限制的强大细胞毒反应[7]，在肿瘤的过继免疫治疗中显示出了重大的应用价值。DC是人体功能最强的抗原提呈细胞，由DC与CIK细胞共培养形成的DC-CIK细胞，具有比CIK细胞更强的增殖活性及细胞毒性，并在临床应用中具有更少的不良反应[8]。DC-CIK细胞疗法在临床上已用于甲状腺癌、肺癌、结直肠癌，肝癌等恶性肿瘤，并取得了一定的治疗效果[9]。

Toll样受体（TLRS）属于模式识别受体家族，可以识别多种病原微生物产物及内源性配体[10-11]，其中，TLR4是TLRs家族成员中研究较深入的受体之一。TLR4广泛表达于多种免疫细胞，它介导MyD88依赖性及非依赖性信号途径，从而促进免疫细胞产生IL-6、IL-8及TNF-α等炎性细胞因子[12]。鉴于TLR4在免疫系统中的重要作用，

TLR4与肿瘤免疫的关系已有很多研究，研究表明调节性T细胞的TLR4受体激活可能导致肿瘤免疫抑制[13]，死亡肿瘤细胞释放的高迁移率族蛋白1（HMGB1）和DC细胞表达的TLR4的相互作用是肿瘤细胞免疫抗原交叉递呈所必需的，也可以促进肿瘤细胞毒T细胞特有的反应[14]。但DC-CIK治疗后，NSCLC患者外周血PBMC其表达及功能变化国内外尚未见报道。本研究发现，DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA的表达较治疗前显著降低，在TLR4天然配体脂多糖刺激下，PBMC分泌炎性因子（IL-6、IL-8及TNF-α）显著减少。血清中IL-6细胞因子水平升高与进展期肿瘤患者免疫抑制有关[15]，IL-8是炎症致癌的主要因子之一，与肿瘤的发生、发展密切相关[16]，而TNF-α虽然能直接或介导免疫反应杀伤肿瘤细胞，但如果TNF-α异常增高，会造成肿瘤患者免疫紊乱，使肿瘤细胞逃避宿主免疫监视[17]。这也提示DC-CIK过继免疫治疗可以抑制PBMC的TLR4信号，使TLR4介导的炎症因子产生减少，进而减少慢性炎症及免疫抑制，从而抑制肿瘤的生长和进展。

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Changes of TLR4 mRNA expression in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer after DC-CIK immunotherapy

WANG Xiyong，YUAN Linna，ZHANG Zhihao.Department of Cardiothoracic Surgery，Jiaxing Armed Police Corps Hospital，Jiaxing 314000，China

Objective To investigate the changes of TLR4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cell (PBMC)of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)after DC-CIK immunotherapy.Methods The mRNA expression of TLR4 in PBMC was detected by reverse transcription PCR(PT-PCR)in 50 patients with NSCLC before and after DC-CIK therapy.The secretion of cytokines(IL-6,IL-8 and TNF-α)of PBMC stimulated with LPS was detected by ELISA before and after DC-CIK therapy. Results After DC-CIK treatment,the relative expression level of TLR4 mRNA in PBMC of NSCLC patients was significantly decreased(t=6.272,P＜0.01),the secretion of IL-6(t=17.407,P＜0.01),IL-8(t=15.244,P＜0.01)and TNF-α (t=12.428,P＜0.01)by PBMC stimulated with LPS was significantly decreased. Conclusion DC-CIK immunotherapy can down-regulate TLR4 expression in PBMC of NSCL patients to enhance the anti-tumor immunity.

Dendritic cells(DC) Cytokine-induced killer(CIK) Non-small cell lung cancer TLR4