大黄素对急性肝功能衰竭大鼠肝脏的保护作用机制

于盈 王凤玲

大黄素对急性肝功能衰竭大鼠肝脏的保护作用机制

于盈 王凤玲

目的 探讨大黄素对急性肝功能衰竭（ALF）大鼠肝脏的保护作用机制。方法 将SD大鼠随机分为健康对照组（6只）、ALF模型组（24只）和大黄素保护组（24只）。模型组、保护组用D-氨基半乳糖（D-Gal）建立ALF动物实验模型，12h后保护组按10mg/kg腹腔注射大黄素，2次/d；健康对照组注射等量0.9%氯化钠溶液。模型组、保护组在建模后24、72、120、168h随机各取6只，取门静脉血检测肝功能指标，取肝组织检测其NF-κB水平，并进行比较分析。 结果 模型组造模后24、72、120h ALT水平均明显高于对照组（均P＜0.05），24、72、120、168h AST水平均明显高于对照组（均P＜0.05）；保护组造模后24、72h ALT、AST水平均明显高于对照组（均P＜0.05）；造模后72h ALT、AST水平均为模型组高于保护组（均P＜0.05），造模后120、168h AST水平亦均为模型组高于保护组（均P＜0.05）。HE染色见对照组大鼠肝组织结构完整，能清晰看到肝索；模型组大鼠肝小叶结构明显被破坏，肝细胞大片坏死。造模后24、72、120h模型组、保护组NF-κB水平均明显高于对照组（均P＜0.05），两组均在72h达到高峰；模型组造模后168h明显高于对照组（P＜0.05）；造模后24、72、120、168h模型组均高于保护组（均P＜0.05）。 结论 大黄素对ALF大鼠的肝脏功能有保护作用，其机制可能与下调肝脏组织中NF-κB表达有关。

急性肝功能衰竭 大黄素 核因子-κB 大鼠

肝功能衰竭是由多种因素引起肝细胞合成、分泌以及生物转化功能障碍的一种临床综合征，临床表现以黄疸、肝性脑病、腹腔积液、凝血功能障碍等为主，肝脏组织学可观察到广泛的肝细胞坏死，坏死部位和范围因病因、病程而异。肝功能衰竭包括急性、慢性、亚急性，其中急性肝功能衰竭（ALF）是由肝脏功能急剧减退引起黄疸、凝血功能低下和肝性脑病等临床表现的一种临床综合征。ALF发病急、病情进展迅速，当前临床上尚无有效的治疗方法。大黄是临床治疗ALF应用较为广泛的一种中药，其主要有效成分是大黄素，目前有研究证实大黄素具有多种活性作用，包括抗炎、肝功能保护、免疫调节等，亦有学者应用大黄制剂防治肝癌、保护肝功能等[1－4]。NF-κB参与细胞增殖过程，其在肝脏组织中表达水平的变化能直接反映细胞增殖功能，因此可用来评价肝细胞的再生作用。故本研究通过建立ALF动物实验模型并采用大黄素治疗，观察肝组织病理学改变以及NF-κB表达、肝功能指标的变化，以探讨大黄素对肝脏功能保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 全自动生化分析仪（济宁市润煤工矿物资有限公司）；NF-κB-抗（广州泰诺迪生物科技有限公司）；D-氨基半乳糖（D-Gal，重庆医科大学化学教研室）；大黄素（广州泰诺迪生物科技有限公司，批号：110756-200110）；NF-κB免疫组化试剂盒（广州泰诺迪生物科技有限公司）。

1.2 动物分组 选取54只健康清洁级雄性SD大鼠（温州医学院实验动物中心，动物合格证标号：2010-04-12）54只，体重180～220g。按随机数字表法分成健康对照组（6只）、ALF模型组（24只）和大黄素保护组（24只），3组大鼠均予相同喂养条件和饮食（温度18～26℃，相对湿度5%～10%，噪声＜85dB，每1h通气换风8～12次，饲喂量5g）。本研究符合动物实验伦理学原则。

1.3 模型建立 所有大鼠造模前12h禁食、4h禁饮。称取10g D-Gal溶于100ml 0.9%氯化钠注射液中，用1mol/L NaOH将D-Gal溶液pH调至7.0，最终浓度调至10%。模型组、保护组按照1.25g/kg腹腔注射D-Gal溶液以制作ALF动物实验模型，对照组注射等量0.9%氯化钠溶液；造模12h后保护组按10mg/kg腹腔注射大黄素，2次/d。

1.4 检测方法 对照组给药24h后取静脉血，遂将大鼠经颈椎脱臼法处死并固定于解剖板上，用碘酒消毒后沿腹中线打开腹腔，取中央肝组织；模型组和保护组分别在给药24、72、120、168h时取6只大鼠行腹腔麻醉、采集静脉血、取肝组织，方法同上。静脉血离心取上清液，－80℃冰箱保存；肝组织用甲醛固定，行病理及免疫组化检测。（1）使用全自动生化分析仪检测血清标本中ALT、AST等肝功能指标变化。（2）将甲醛固定的肝组织用石蜡包埋切片，HE染色，在显微镜下观察肝组织病理学变化。将甲醛固定的肝组织脱水，严格按试剂盒说明检测NF-κB水平。采用苯基丁酸（PBA）为阴性对照，以出现棕黄色细胞核为阳性。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析并测量肝组织平均光密度值（OD），OD=积分光密度/组织面积。

1.5 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件。计量资料用表示，组别间比较采用t检验。

2 结果

2.1 3组大鼠肝功能指标变化 模型组造模后24、72、120h ALT水平均明显高于对照组（均P＜0.05），24、72、120、168h AST水平均明显高于对照组（均P＜0.05）；保护组造模后24、72h ALT、AST水平均明显高于对照组（均P＜0.05）。造模后72h ALT、AST水平均为模型组高于保护组（均P＜0.05），造模后120、168h AST水平亦为模型组高于保护组（均P＜0.05），见表1。

表1 3组大鼠不同时间点肝功能指标变化

2.2 肝组织病理学改变 对照组大鼠肝组织结构完整，能清晰看到肝索，见图1a；模型组大鼠肝小叶结构明显被破坏，肝细胞大片坏死，见图1b。

图1 大鼠肝组织病理学改变（a：对照组；b：模型组；HE染色，×400）

2.3 3组大鼠肝组织中NF-κB表达水平变化 对照组NF-κB不表达或有少量表达，NF-κB表达水平为（0.038±0.004）μg/ml。造模后24、72、120h模型组、保护组NF-κB水平均明显高于对照组（均P＜0.05），两组均在72h达到高峰；模型组造模后168h NF-κB表达水平亦明显高于对照组（P＜0.05）。造模后24、72、120、168h NF-κB表达水平为模型组高于保护组（均P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠不同时间点肝组织中NF-κB表达水平比较（μg/ml）

3 讨论

ALF最突出的表现是短时间内肝细胞变性、坏死，炎症因子明显增加。由于ALF病情进展快且存在多种并发症，因此其临床治疗难度大、预后差、病死率高。目前肝移植治疗肝功能衰竭较为有效，但存在供体缺乏、费用昂贵等问题，故尚未推广应用[5－6]。因此，本研究探索一种中药治疗方法具有现实意义。

大黄素是大黄主要有效成分之一，属于蒽醌类，近年来在医学领域中的相关研究较为广泛。目前已证实大黄素具有保护肝细胞、抗炎、抗肿瘤等生物学作用；此外，大黄素对机体具有双重调节作用，既能抑制T淋巴细胞增殖，减少脓毒血症阳性率，减少炎症因子过度释放，又能抑制不同有丝分裂刺激脾细胞增殖。有学者应用大黄素治疗急性胰腺炎发现，连续治疗1周的患者血淀粉酶、二胺氧化酶（DAO）等明显下降，且明显低于对照组，推测大黄素能抑制钠离子、钾离子，促进上皮细胞离子主动运转，具有广泛抗菌、抗病毒的效果[7]。

本研究结果发现，保护组血清ALT、AST水平明显下降，且低于模型组，说明大黄素对肝功能有一定保护作用。相关研究发现大黄素能抑制炎症因子，减少内毒素血症，此外在清除氧自由基、减少炎症递质方面也有明显作用[8]。其他研究还发现注射大黄素后体内炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-1等分泌明显减少，认为大黄素能减少肝细胞凋亡、减轻炎症反应[9]。本研究中大黄素对肝的保护作用可能与上述机制有关。由于细胞DNA合成与NF-κB密切相关[10]；NF-κB表达量能直接反映细胞增殖和复制活跃程度，是反映细胞增殖效应的重要指标[11-14]。本研究比较NF-κB表达发现随着时间的推移，模型组大鼠肝组织中NF-κB水平明显上升，造模后72h达高峰；而保护组大鼠肝组织中各时间点NF-κB水平均明显低于模型组。这说明大黄素不仅对ALT、AST产生影响，还会影响NF-κB表达水平；提示大黄素可能通过抑制炎性细胞分泌和聚集以减少NF-κB表达，进而发挥抗细胞凋亡的作用。

综上所述，大黄素可能减少炎性细胞的释放，抑制IKK细胞信号传导通路，进而达到抑制肝细胞凋亡的效果，为肝细胞再生提供微环境。以上可能是大黄素治疗ALF的机制，这为大黄素的临床应用提供了理论基础。

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Effects of emodin on liver function in rats with acute liver failure and its mechanism

YU Ying,WANG Fengling.Department of Infectious Diseases,Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000，China

Objective To investigate the effect of emodin on liver function in acute hepatic failure and its mechanism. Methods SD rats were randomly divided into three groups:healthy control group(n=6),acute liver failure(ALF)model group (n=24)and emodin treatment group (n=24).Acute liver failure was induced by intraperitoneal injection of D-galactosamine (D-Gal).Twelve hours after the model was established,the emodin group received intraperitoneal injection of 10mg/kg emodin twice daily.At 24,72,120 and 168h after modeling,6 rats were sacrificed in ALF group and emodin group.The portal vein blood samples were collected and hepatic function was examined.Liver tissue was fixed with 10%formalin,and the expression of NF-κB in liver tissue was detected by immunohistochemistry. Results After 24h of modeling,the levels of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in serum were significantly higher than those in healthy control group (P＜0.01),after 72h of modeling,the liver function of rats in ALF group was significantly higher than of emodin group at the same time point(P＜0.01),after 24h of modeling,the expression of NF-κB in ALF group was significantly higher than that in healthy control group(P＜0.01),reached the peak at 72h,then decreased after 120h.The expression of NF-κB in emodin group was significantly lower than that in ALF group at 72,120 and 168h after modeling(P＜0.01). Conclusion Emodin has protective effect on acute liver failure in rats,which may be related to the down-regulation of NF-κB expression.

Acute liver failure Emodin NF-κB Rat

2017-01-03）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2017-21

浙江省中医药科学研究基金计划项目（2010ZA118）；台州市椒江区科技计划项目（112070）

318000 台州市立医院感染内科

于盈，E-mail：lhjyy@126.com