海口地区新生儿G6PD基因突变分析

刘秀莲 王洁黄慈丹 林文 杨春

海口地区新生儿G6PD基因突变分析

刘秀莲 王洁★黄慈丹 林文 杨春

目的 了解海口地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的发生率及基因突变特点。 方法 用荧光斑点法对2016年1月1日至2016年2月24日出生于海口的5 295例新生儿进行G6PD活性筛查，对173例初筛阳性的标本用多色探针荧光PCR熔解曲线法（MMCA）进行基因分型。结果 本次筛查发现海口地区新生儿群体的G6PD缺乏症发生率为3.87%（205/5 295），其中男女发生率分别为4.99%（142/2 848）和2.57%（63/2 447）。173例初筛阳性标本中检出142例（82.08%）有基因突变，基因携带率为3.18%（142/5 295/84.39%）。共检出6种基因突变类型，含74例（52.11%）c.1376 G＞T，33例（23.24%）c.1388 G＞A，13例（9.15%）c.95 A＞G，8例（5.63%）c.1024 C＞T，4例（2.82%）c.871 G＞A，5例（3.52%）c.392 G＞T，并检出3例（2.11%）c.1376 G＞T复合c.1388 G＞A突变、1例（0.71%）c.392 G＞T复合c.517 T＞C突变、1例（0.71%）c.95 A＞G复合c.1388 G＞A突变。 结论 海口地区是G6PD缺乏症高发地区，c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95 A＞G是主要的3种基因突变型。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症；基因突变；多色探针荧光PCR熔解曲线法

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症，又称蚕豆病，是一种X连锁不完全显性遗传性溶血性酶缺陷疾病，临床表现差异大，从无症状到新生儿黄疸、药物或感染引起的急性溶血、蚕豆病和慢性非球形细胞溶血性贫血，严重者导致新生儿期核黄疸，引起死亡或永久性神经系统的损伤。该病在我国呈“南高北低”的分布特点，以广东、广西及海南发病率最高［1］。据统计2007至2010年海南省新生儿G6PD缺乏症发生率为3.17%［2］。海口市地处海南省北部，总人口222.3万，以汉族人群为主。本文采用多色探针荧光PCR熔解曲线法（multicolor melting curve analysis，MMCA）对新生儿滤纸干血片进行基因检测，以探讨海口地区G6PD基因突变类型及其分布特点。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2016年1月1日至2016年2月24日出生于海口市内各家医院的5 295例新生儿，男性2 848例，女性2 447例，男女比例为1.16∶1。出生3 d后采集足跟血，制成滤纸干血斑标本。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器

实验中用到的仪器设备有：赛默飞世尔微孔板孵育振荡器THERMO-IEMS 1415、芬兰1 420时间分辨免疫分析仪、厦门致善核酸提取仪Lab-AidTM824及上海宏石全自动医用PCR分析系统SLAN-96S。

1.2.2 试剂

红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性筛查试剂盒（纯化学反应荧光法）来源于广州市米基医疗器械有限公司，试剂批号Y150810-08。

Lab-Aid核酸提取Micro试剂盒（试剂批号160607）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测试剂盒-荧光PCR熔解曲线法（试剂批号16070102）均来源于厦门致善生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 G6PD荧光斑点定性试验

采用红细胞G6PD活性筛查试剂盒进行G6PD活性筛查，步骤如下：（1）用打孔器在滤纸干血斑标本上打下1个直径3 mm的小血片置于空白微量板中；加入荧光反应试剂120 μL/孔，于Thermo iEMS微孔板孵育振荡器中37℃恒温900 r/min振幅振动30 min后，去纸片再振荡1 min，用芬兰1420时间分辨免疫分析仪读取荧光数值。结果判读：荧光数值＞1 600为活性正常，荧光数值≤1 600为活性缺乏。

1.3.2 G6PD突变基因检测

收集G6PD活性缺乏的滤纸干血斑，打下2个直径3 mm的小血片，用核酸提取仪Lab-Aid824提取基因组DNA。然后采用带有FAM、HEX、ROX 和Cy5检测通道且具有熔解曲线分析功能的PCR 仪SLAN-96，同时进行基因扩增和熔解曲线分析，结果参照试剂盒说明书进行基因型判读：通过比较待检样本与野生型对照的熔解峰之间熔点（Tm值）的差异判断样本是否发生突变及突变的类型。该G6PD基因突变检测试剂盒可检测中国人常见的16种G6PD基因突变类型：c.95A＞G、c.383T＞C、c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.1381G＞A、c.1387C＞T、c.493A＞G、c.519C＞T。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计数资料用百分率表示。

2 结果

2.1 海口地区新生儿G6PD缺乏症发生率

在5 295例（男2 848例，女2 447例）新生儿中，检出G6PD活性缺乏205例（男142例，女63例），总发生率3.87%（205/5 295）；其中，男女发生率分别为4.99%（142/2 848）和2.57%（63/2 447）。男性发生率明显高于女性，符合X连锁不完全显性遗传规律。

2.2 G6PD缺乏症患者基因突变分析

在G6PD活性缺乏的205例样本中，剔除血斑质量差和血斑不足的样本，还有173例（男126例，女47例）进行基因突变检测，基因检测受检率为84.39%（173/205）。经MMCA检测，在173例受检样本中检出142例有G6PD基因突变，其中男105例，女37例，基因突变率82.08%，见表1。据此推算海口地区新生儿群体的G6PD基因携带率为3.18% （142/5 295/84.39%）。

2.3 G6PD基因突变类型和分布特点

142例新生儿G6PD缺乏症患者中共检出6种G6PD 基 因 突 变 型 ：c.1024C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.392G＞T、c.871G＞A、c.95A＞G和3种复合突变，各基因突变类型和分布情况见表2。

表1 海口地区新生儿G6PD缺乏症基因突变率Table 1 Genotypic mutation rate of G6PD deficiency in neonates of Haikou area

表2 142例新生儿G6PD缺乏症患者基因突变类型结果Table 2 Genotype mutant results of 142 neonates with G6PD deficiency

3 讨论

G6PD缺乏症在我国呈“南高北低”的分布特点，以广东、广西及海南发病率最高。据北京国家临床实验中心2013年196个实验室上报的30 000万新生儿筛查结果显示，G6PD的发生率为1∶44［3］。本研究结果显示，海口地区新生儿G6PD缺乏症的发生率为3.87%，接近于海南省的发生率3.17%［2］，但低于澄迈县人群的发生率5.54%［4］，说明G6PD缺乏症的发生率具有一定的地域或群体特异性。

G6PD缺乏症主要是由于基因突变引起的，因编码区内碱基突变导致酶活性改变，形成血管内溶血，临床上常表现为新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血等。该病也是新生儿高胆红素血症的重要病因［5］。迄今，全球已发现近200种G6PD基因突变［6］，我国已发现的突变类型则超过30种［7-8］。G6PD缺乏症目前尚无有效的根治方法，所以及早筛查与确诊以及采取积极有效的预防措施、控制诱因，是减少G6PD缺乏症发生最有效的措施。

多色探针荧光PCR熔解曲线法（MMCA）是检测中国人常见的16种G6PD基因突变类型的新方法。该法不易造成交叉污染，具有操作简便、高通量和结果易判读的优点［9］。本研究在173例G6PD活性缺乏样本中检出6种基因突变：c.1376G＞T （52.11%）、c.1388G＞A（23.24%）、c.95A＞G（9.15%）、c.1024 C＞T（5.63%）、c.392 G＞T（3.52%）和c.871 G＞A（2.82%），这和陈开科等［4］在72例G6PD缺乏的澄迈人群样本中检出的6种G6PD基因点突变类型是一致的，但各种突变类型所占的比例有所不同，说明不同地区人群的G6PD基因突变谱不同。中国人最常见的3种G6PD基因类型［10］，即c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95A＞G，在本组样本中检出的比例共占84.5%，表明c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95A＞G是海口地区新生儿主要的基因突变型，这和以往的报道相符合［7，11-12］。同时本研究还检测到3例c.1376 G＞T复合c.1388 G＞A、1例c.392 G＞T复合c.517 T＞C、1例c.95 A＞G复合c.1388 G＞A，这5例复合突变都发生于G6PD活性缺乏的女性，提示复合突变很可能是双杂合子，而不是单倍型，有待进一步追查其双亲的基因型以确定。这些复合突变会引起怎样的临床结果，也有待后续的追踪观察。本研究未检测到c.383T＞C、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.1004C＞A、c.1360C＞T、c.1381G＞A、c.1387C＞T、c.493A＞G和c.519C＞T等突变，可能与基因检测的标本量较小有关。

本研究173例G6PD活性缺乏者中，有31例未检测到基因突变，分析原因可能是：（1）含有16个突变位点以外的基因突变类型，有待下一步通过基因测序法进行检测确认；（2）某些疾病或者药物的影响，降低了G6PD酶活性；（3）31例样本中有29例是由海口市内其他医院采集后，一周内递送至笔者所在医院，标本采集不规范、运送时间长或处理不当等因素均会使G6PD失活，导致其活性降低。

海口地区是G6PD缺乏症的高发区，新生儿G6PD缺乏症发生率为 3.87%，基因突变以c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.95 A＞G基因型为主，利用滤纸干血斑标本在新生儿群体中开展G6PD缺乏症的表型筛查和基因型检测，对高危人群给予干预指导和建议能有效减少溶血性贫血的发生，避免给患者家庭造成更大的经济与精神负担。

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Genotyping analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in neonates of Haikou area

LIU Xiulian，WANG Jie★，HUANG Cidan，LIN Wen，YANG Chun
（Center of Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Care Hospital of Hainan Province，Haikou，China，570206）

Objective To investigate the prevalence and genotypic mutant characteristics of the glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)deficiency in neonates of Haikou area. Methods A total of 5 295 neonates born in the Hospital of Haikou area were screened for G6PD deficiency by inflorescent spot test(FST) from January 1,2016 to February 24,2016.Then,173 positive screening samples were subjected to genotyping through multicolor melting curve analysis(MMCA). Results The prevalence of G6PD deficiency in Haikou was 3.87%(205/5 295),of the 205 infants suspected to be G6PD deficiency based on FST,142(4.99%,142/2 848) were males and 63(2.57%,63/2 447)were females.Among these 173 positive screening samples based on FST, 142 had a gene mutation;6 kinds of mutation were found including 74 cases of c.1376 G＞T(52.11%),33 cases of c.1388 G＞A(23.24%),13 cases of c.95 A＞G(9.15%),8 cases of c.1024 C＞T(5.63%),4 cases of c.871 G＞A (2.82%),5 cases of c.392 G＞T(3.52%);and 3 cases with both c.1376 G＞T and c.1388 G＞A(2.11%),1 case with both c.392 G＞T and c.517 T＞C(0.71%),1 case with both c.95 A＞G and c.1388 G＞A(0.71%). Conclusion The incidence of G6PD deficiency is high in Haikou area.The three G6PD mutations at 1376,1388 and 95 are the most common variants in this area.

Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency;Genotypic mutation;Multicolor melting curve ana

海南省自然科学基金面上项目（20168327）

海南省妇幼保健院检验中心，海南，海口570206

★通讯作者：王洁，E-mail:wj59726@sina.com