PDTC和姜黄素对抗β2GPI抗体诱导小鼠表达组织因子的影响①

夏龙飞 巨红妹 周 红 王 婷

(江苏大学医学院，镇江212013)

PDTC和姜黄素对抗β2GPI抗体诱导小鼠表达组织因子的影响①

夏龙飞 巨红妹②周 红 王 婷

(江苏大学医学院，镇江212013)

目的：本研究拟探讨PDTC和姜黄素对抗β2GPI抗体诱导小鼠组织因子(Tissue factor，TF)表达的影响。方法：BALB/c小鼠先用 PDTC[100 mg/(kg·d)]或/和姜黄素[50 mg/(kg·d)]预处理2 h，再进行腹腔注射anti-β2GPI(500 μg/只)，取小鼠腹腔巨噬细胞、双侧颈动脉和胸主动脉，超声裂解，收集细胞总RNA和蛋白，实时定量PCR(Real-time qPCR)检测细胞TF mRNA水平，TF活性试剂盒检测TF活性，Western blot方法检测NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、c-Jun和磷酸化 p-c-Jun的表达情况。结果：抗β2GPI抗体能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞TF的表达及NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化，与对照相比差异有统计学意义(P<0.05 vs NR-IgG)；PDTC和姜黄素均能抑制抗β2GPI抗体诱导小鼠TF的表达以及NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化效应(P<0.05 vs anti-β2GPI)，但是二者没有协同作用。结论：PDTC和姜黄素均能影响抗β2GPI抗体诱导小鼠TF的表达，表明其具有防治血栓形成的潜力。

抗磷脂综合征；抗β2GPI抗体；PDTC；姜黄素；组织因子

抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome，APS)是一种非器官特异性自身免疫性疾病，血栓形成是其主要的病理基础和最突出的临床表现，也是APS患者死亡的首要原因[1]。研究表明，血清中存在高滴度的抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，aPL)(尤其是抗β2GPI抗体)是APS患者血栓形成的关键因素，但具体机制仍不清楚[2,3]。本课题组前期研究发现，anti-β2GPI/β2GPI复合物能刺激核因子κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)和激活蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)的活化，诱导单核细胞表达组织因子(Tissue factor，TF)和炎症因子，从而导致血液处于高凝状态[4]。体外研究发现，NF-κB抑制剂PDTC和AP-1抑制剂姜黄素均能抑制抗β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF的表达[4]。PDTC和姜黄素在体内能否影响aPL/anti-β2GPI诱发的血栓形成，目前仍缺乏足够的体内研究来证明。因此，本论文旨在前期研究的基础上，利用BALB/c小鼠腹腔注射anti-β2GPI建立实验性APS(EAPS)小鼠模型，探讨PDTC或/和姜黄素在anti-β2GPI诱导血栓形成中的作用，以期为APS血栓形成的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1主要材料及试剂 BALB/c小鼠(扬州大学比较医学中心)，PDTC和姜黄素(Sigma公司)，RPMI1640 (Gibco公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒和定量PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，TF活性试剂盒(Assaypro公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技术公司)，兔抗小鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65、c-Jun、p-cJun 抗体(Cell Signaling Technology公司)，兔抗小鼠β-actin抗体(Protein tech Group公司)，HRP标记的羊抗兔IgG(Bioworld公司)，ECL显色试剂(Millipore公司)，健康兔来源的IgG(NR-IgG)、兔抗人β2GPI多克隆抗体、APS病人来源的IgG(IgG-APS)和β2GPI(本实验室制备)，引物(设计采用primer 5.0，由上海生物工程有限公司合成)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1动物模型的制备 BALB/c小鼠均为8～10周龄雄性小鼠，体重大约22 g左右。BALB/c小鼠分别于0、48 h腹腔注射NR-IgG(500 μg/只)或anti-β2GPI(500 μg/只)或IgG-APS(500 μg/只)，72 h 后处死小鼠，取小鼠腹腔巨噬细胞、双侧颈动脉和胸主动脉用于实验。在特定的试验中，BALB/c小鼠先用PDTC[100 mg/(kg·d)]或/和姜黄素[50 mg/(kg·d)]预处理2 h，再腹腔注射anti-β2GPI。每组小鼠9～10只，实验重复3次。

1.2.2总RNA的提取和逆转录 将取下的胸主动脉置于预冷的PBS缓冲液中，在解剖显微镜下剥去血管外膜，将剩下的组织剪成小块，放在含100 μl Trizol试剂的1.5 ml EP中，待反应20 min，置于-80℃过夜保存，次日取出，用DEPC水处理过的玻璃研磨棒使其充分溶解，加入900 μl Trizol试剂，室温静止20 min；用10 ml PBS冲洗小鼠腹腔,收集腹腔冲洗液，800 r/min离心5 min，弃上清，1 ml无血清RPMI1640重悬细胞，接种于6孔板内，37℃、5% CO2培养1 h，弃掉上清培养基，加入1 ml Trizol试剂裂解细胞，收集裂解液于1.5 ml EP中，室温放置20 min。按Trizol说明书提取总RNA，逆转录体系共10 μl，按照试剂盒说明书进行操作： RNA 500 ng、4×g DNA Wiper Mix 2 μl和ddH2O加起来8 μl，42℃ 2 min；再加入2 μl 5×qRT SuperMix Ⅱ,反应条件：25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min。反应所得cDNA用于检测mRNA表达。

1.2.3实时定量PCR(Real-time qPCR) 运用Bio-Rad CFX96定量PCR分析仪检测TF mRNA水平，总反应体系为20 μl：其中SYBR Mix 10 μl，5 μmol/L上下游引物各0.8 μl，cDNA模板1.0 μl，最后用灭菌ddH2O补足至20 μl。TF引物序列为：上游5′-TCAAGCACGGGAAAGAAAAC-3′，下游5′-CTGCTTCCTGGGCTATTTTG-3′，扩增产物为137 bp；GAPDH引物序列为：上游5′-GGCATTGCTCTAATGACAA-3′，下游5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′，扩增产物为200 bp。Real-time qPCR循环参数为：95℃预变性5 min；95℃ 10 s，退火温度60℃(TF)/58℃(GAPDH)10 s，72℃ 10 s；40个循环扩增。采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达水平。

1.2.4Western blot 将取下的胸主动脉剪碎，放在含100 μl RIPA裂解液的1.5 ml EP中，置于-80℃快速冷冻，用玻璃研磨棒使其充分溶解，超声裂解；收集贴壁的腹腔巨噬细胞，放在含100 μl RIPA裂解液的1.5 ml EP中，超声裂解；将上述标本置于冰上裂解1 h，4℃ 12 000 r/min离心10 min，收集裂解上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入适量的上样缓冲液，100℃煮沸10 min，-20℃保存；12% SDS-PAGE电泳，350 mA恒流转印至PVDF膜； 5%脱脂牛奶室温封闭1 h；分别与相应的兔抗小鼠NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、c-Jun(1∶1 000)、p-c-Jun(1∶1 000)或β-actin抗体(1∶2 500)4℃孵育过夜； TBS/T洗涤3次，15 min/次；与HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)37℃孵育1 h；TBS/T洗涤3次，15 min/次，ECL显色系统定影显色，观察杂交条带，同时运用分子成像系统扫描条带并读取灰度值。

1.2.5TF活性检测 利用TF/Ⅶa复合物使因子Ⅹ转变为活化因子Ⅹa，根据Ⅹa生成量来判定细胞TF的活性。测定标本为颈动脉和腹腔巨噬细胞裂解物，严格按照试剂盒说明书操作。最后测定每孔的吸光度值，按照说明书计算样本的TF活性，TF活性结果以pmol/L表示。

2 结果

2.1抗β2GPI和IgG-APS均能诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达TF mRNA及活性 前期体外研究发现，抗β2GPI/β2GPI复合物能够诱导单核细胞TF的表达，为了证明抗β2GPI抗体也能够刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TF。本研究首先观察腹腔注射抗β2GPI抗体能否诱导BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞TF的表达。本实验设NR-IgG(对照组，500 μg/只)、抗β2GPI(500 μg/只)和IgG-APS阳性对照(500 μg/只)，收集小鼠腹腔巨噬细胞，提取总RNA和蛋白，Real-time qPCR和TF活性试剂盒检测细胞内TF的表达。结果显示，抗β2GPI和IgG-APS均能明显增加小鼠腹腔巨噬细胞TF mRNA(图1A)和活性的表达(图1B)，与NR-IgG对照组比较，差异显著(P<0.05)。值得注意的是，抗β2GPI与IgG-APS诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达TF的能力是一致的。

2.2抗β2GPI和IgG-APS均能诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB和AP-1的活化 为了观察抗β2GPI和IgG-APS能否影响小鼠NF-κB和AP-1的活化，收集小鼠腹腔巨噬细胞，提取细胞总蛋白，Western blot检测NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情况。结果表明，抗β2GPI和IgG-APS均能增强小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，而对NF-κB p65和c-Jun/AP-1总蛋白的表达无影响(图2)。此外，抗β2GPI与IgG-APS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平是相似的。

2.3PDTC和姜黄素对小鼠NF-κB p65和c-Jun/AP-1磷酸化水平的影响 利用NF-κB抑制剂PDTC和AP-1抑制剂姜黄素，进一步证明抗β2GPI抗体对NF-κB和c-Jun/AP-1活化的影响。BALB/c小鼠先用PDTC 100 mg/(kg·d)或/和姜黄素50 mg/(kg·d)预处理2 h，再用抗β2GPI腹腔注射，72 h处死小鼠，收集小鼠胸主动脉和腹腔巨噬细胞，Western blot检测NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情况。研究结果显示，PDTC和姜黄素分别能明显抑制抗β2GPI诱导小鼠胸主动脉和腹腔巨噬细胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，且二者并未显示增强的抑制效应(图3)。此外，研究结果还发现，姜黄素也能明显降低抗β2GPI诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65的磷酸化水平，且对主动脉NF-κB p65的磷酸化水平也有微弱的抑制效应。

图1 Anti-β2GPI和IgG-APS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TF mRNA表达及TF活性Fig.1 Anti-β2GPI and IgG-APS induce TF mRNA expre-ssion and TF activity in mouse periton-eal macrophagesNote:**.P<0.05 vs NR-IgG.

2.4PDTC和姜黄素对抗β2GPI诱导小鼠表达TF的影响 本实验进一步观察了PDTC和姜黄素对抗β2GPI诱导小鼠TF表达的影响。Real-time qPCR和TF活性检测结果显示，PDTC或/和姜黄素均能显著抑制抗β2GPI诱导小鼠胸主动脉和腹腔巨噬细胞TF mRNA的表达(图4A)；也能抑制小鼠颈动脉和腹腔巨噬细胞中TF活性的升高(图4B，P<0.05)。PDTC刺激组显示出最强的抑制效应，然而二者联合使用时没有协同效果。

图2 Anti-β2GPI和IgG-APS对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB和AP-1磷酸化水平的影响Fig.2 Effects of anti-β2GPI or IgG-APS on NF-κB p65 and AP-1 phosphorylation in mouse periton-eal macrophages

图3 PDTC和姜黄素对小鼠NF-κB p65和c-Jun/AP-1磷酸化水平的影响Fig.3 Effects of PDTC and curcumin on NF-κB p65 and AP-1 phosphorylation in mice

图4 PDTC和姜黄素对抗β2GPI诱导小鼠表达TF的影响Fig.4 Effects of PDTC and curcumin on anti-β2GPI-induced TF expression in miceNote:*.P<0.05 vs anti-β2GPI；**.P<0.05 vs NR-IgG.

3 讨论

体内外研究表明，抗β2GPI抗体在APS血栓形成的病理机制中发挥重要的作用，但具体机制尚不清楚[5]。抗β2GPI抗体/β2GPI复合物可通过激活血液单核细胞和血管内皮细胞，促使其分泌并释放TF，而成为促进血栓形成的机制之一[3,6，7]。近年来有文献报道，NF-κB参与介导了aPL诱导内皮细胞和单核细胞的活化，凝血酶能通过AP-1途径诱导大鼠血管平滑肌细胞表达TF，促进凝血反应[8]。本课题组前期研究发现，NF-κB和c-Jun/AP-1也参与介导了抗β2GPI/β2GPI诱导单核细胞表达TF的过程[4]。因此，本研究拟用PDTC(NF-κB抑制剂)和姜黄素(AP-1抑制剂)探讨NF-κB和c-Jun/AP-1在β2GPI诱导小鼠表达TF过程中的作用。

首先，本研究为了验证抗β2GPI抗体和IgG-APS能诱导小鼠表达TF、活化NF-κB和c-Jun/AP-1，先用抗β2GPI抗体或IgG-APS腹腔注射雄性BALB/c小鼠来建立EAPS小鼠模型，收集小鼠腹腔巨噬细胞。研究结果发现，抗β2GPI抗体和IgG-APS均能诱导小鼠腹腔巨噬细胞TF的表达和NF-κB和c-Jun/AP-1的活化，这与先前的实验结果一致[4,9]。研究发现抗β2GPI抗体与IgG-APS的刺激效果是一致的，故使用抗β2GPI抗体进行后续研究。然后，采用NF-κB抑制剂PDTC和AP-1抑制剂姜黄素进行干预实验，从反面验证抗β2GPI能诱导小鼠NF-κB和c-Jun/AP-1的活化。结果显示，PDTC和姜黄素分别能降低抗β2GPI诱导小鼠胸主动脉和腹腔巨噬细胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，且二者没有共同的抑制效应。此外，姜黄素也能显著降低抗β2GPI诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65的磷酸化水平，对主动脉NF-κB p65磷酸化水平也有微弱地抑制效应。可能的原因是，姜黄素的功效是细胞特异性，并且对NF-κB具有抑制效应。文献报道，姜黄素可通过抑制NF-κB的核易位来调节LPS诱导大鼠血管平滑肌细胞炎症因子的表达，也可通过抑制NF-κB和AP-1的表达和转录活性来调节细胞内信号转导途径[10-12]。

最后，为了进一步证明NF-κB和c-Jun/AP-1介导抗β2GPI诱导小鼠TF的表达，采用PDTC和姜黄素进行干预实验。PDTC和姜黄素均能显著抑制抗β2GPI诱导颈动脉和腹腔巨噬细胞中TF活性的上调，其中PDTC发挥出最强的抑制效应。PDTC和姜黄素对胸主动脉和腹腔巨噬细胞中TF mRNA和蛋白的抑制效应，与其对TF活性的抑制效应是相似的，且二者联合处理时没有叠加效应。因此，我们推测NF-κB和c-Jun/AP-1在调控表达靶分子的过程中起重要作用，因为TF启动序列中含有2个AP-1和1个NF-κB结合位点[4,13]。更重要的是，首次表明c-Jun/AP-1介导了抗β2GPI诱导小鼠体内TF的表达。本研究结果表明，NF-κB和c-Jun/AP-1在aPL诱导APS血栓形成中发挥重要作用，但没有深入探讨具体的机制，此外也需要选择特异性的AP-1抑制剂进行研究。

综上所述，本研究结果发现，PDTC和姜黄素能通过调控NF-κB和c-Jun/AP-1的活化，影响抗β2GPI抗体诱导小鼠TF的表达，表明其具有防治血栓形成潜力。

[1] Chaturvedi S，McCrae KR.Recent advances in the antiphos-pholipid antibody syndrome[J].Curr Opin Hematol，2014，21(5)：371-379.

[2] Allen KL，Fonseca FV，Betapudi V，etal.A novel pathway for human endothelial cell activation by antiphospholipid/anti-β2 glycoprotein I antibodies[J].Blood，2012，119(3)：884-893.

[3] Giannakopoulos B，Krilis SA.The pathogenesis of the antiphospho-lipid syndrome[J].N Engl J Med，2013，368(11)：1033-1044.

[4] Xia L，Zhou H，Hu L，etal.Both NF-kappaB and c-Jun/AP-1 involved in anti-β2GPI/β2GPI-induced tissue factor expression in monocytes[J].Thromb Haemost，2013，109(4)：643-651.

[5] Gómez-Puerta JA，Cervera R.Diagnosis and classification of the antiphospholipid syndrome[J].J Autoimmun，2014，48-49：20-25.

[6] 陈东东，周 红，解鸿翔，等.MAPKs途径在anti-β2GPI/β2GPI刺激THP-1细胞表达TF过程中的作用探讨[J].中国免疫学杂志，2012，28 (2):99-103.

[7] Xu G，Wen H，Zhou H，etal.Involvement of IRAKs and TRAFs in anti-β2GPI/β2GPI-induced tissue factor expression in THP-1 cells[J].Thromb Haemost，2011，106 (6)：1158-1169.

[8] Ko WC，Chen BC，Hsu MJ，etal.Thrombin induced connective tissue growth factor expression in rat vascular smooth muscle cells via the PAR-1/JNK/AP-1 pathway[J].Acta Pharmacol Sin，2012，33(1)：49-56.

[9] Xie H，Sheng L，Zhou H，etal.The role of TLR4 in pathoph-ysiology of antiphospholipid syndrome-associated thrombosis and pregnancy morbidiy[J].Br J Haematol，2014，164(2)：165-176.

[10] Meng Z，Yan C，Deng Q，etal.curcumin inhibits LPS-induced inflammation in rat vascular smooth muscle cells in vitro via ROS-relative TLR4-MAPK/NF-κB pathways[J].Acta Pharmacol Sin，2013，34(7)：901-911.

[11] Zhong Y，Liu T，Guo Z.curcumin inhibits ox-LDL-induced MCP-1 expression by suppressing the p38MAPK and NF-kappaB pathways in rat vascular smooth muscle cells[J].Inflamm Res，2012，61(1)：61-67.

[12] Dehghan MH，Mirmiranpour H，Faghihi-Kashani S，etal.Inhibitory effect of curcumin on angiogenesis in a streptozotocin-induced diabetic rat model:An aortic ring assay[J].J Tradit Complement Med，2016，6(4)：437-441.

[13] Bavendiek U，Libby P，Kilbride M，etal.Induction of tissue factor expression in human endothelial cells by CD40 ligand is mediated via activator protein 1,nuclear factor kappa B,and Egr-1[J].J Biol Chem，2002，277(28)：25032-25039.

[收稿2017-01-06 修回2017-03-06]

(编辑 许四平)

EffectsofPDTCandcurcuminonexpressionoftissuefactorinducedbyanti-β2GPIinmice

XIALong-Fei,JUHong-Mei,ZHOUHong,WANGTing.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China

Objective:To investigate whether PDTC or curcumin had effect on anti-β2GPI-induced tissue factor (TF) expression in mice.Methods:BALB/c mice were pretreated with PDTC (100 mg/kg,once a day) by intraperitoneal injection (i.p.) or/and curcumin (50 mg/kg,once a day) by oral gavage for 3 consecutive days at 2 h before 500 μg of anti-β2GPI injections in subsequent experiments.Mouse peritoneal macrophages and aorta were collected,homogenized by sonication.The total RNA and protein were collected from each animal,TF expression was detected by Real-time quatitative PCR and TF activity kit.The phosphorylation of NF-κB p65 and c-Jun/AP-1 was determined by Western blot.Results:Anti-β2GPI cloud significantly upregulate TF expression and phosphorylation of NF-κB p65 and c-Jun/AP-1 in mouse peritoneal macrophages and aorta,compared with NR-IgG treated mice (P<0.05).PDTC or/and curcumin could markedly attenuate anti-β2GPI-induced TF expression,also inhibit activation of NF-κB p65 and c-Jun/AP-1 in the aorta and peritoneal macrophages respectively (P<0.05),but combination of two inhibitors had no synergistic effect.Conclusion:Both PDTC and curcumin could affect the expression of TF induced by anti-β2GPI in mice,indicating that PDTC and curcumin has the potential to prevent thrombosis in APS.

Antiphospholipid syndrome;Anti-β2GPI;PDTC;Curcumin;Tissue factor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.004

①本文受国家自然科学基金资助项目 (No. 81370614)。

②河北医科大学第四医院输血科，石家庄 050000。

夏龙飞 (1987年-)，男，在读博士，初级检验师，主要从事血栓与止血方面的研究，E-mail：xlf359178760@126.com。

及指导教师：周 红 (1957年-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事血栓与止血方面的研究，E-mail：hongzhou@ujs.edu.cn。

R593.2

A

1000-484X(2017)06-0823-05