版纳微型猪近交系SLA-DOA基因克隆、mRNA表达及蛋白质功能生物信息学分析①

王 配 王淑燕 霍金龙 李罗刚 张永云 李卫真 朱宏涛 姚茂东

(云南农业大学 云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明650201)

·免疫学技术与方法·

版纳微型猪近交系SLA-DOA基因克隆、mRNA表达及蛋白质功能生物信息学分析①

王 配 王淑燕②霍金龙 李罗刚 张永云③李卫真④朱宏涛④姚茂东④

(云南农业大学 云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明650201)

目的：克隆版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)白细胞抗原DO座位alpha亚基(SLA-DOA)的编码序列，并对其19个重要组织mRNA表达作半定量分析。方法：RT-PCR方法获得SLA-DOA的全长cDNA序列；半定量RT-PCR方法分析其在BMI重要组织的mRNA表达谱，并运用生物信息学对其核酸及蛋白序列进行分析，构建系统进化树。结果：BMISLA-DOAcDNA长度为1 079 bp，编码250个氨基酸，蛋白质分子量为27.81 kD，等电点为6.48；位于猪7号染色体，由4个外显子和3个内含子构成；其mRNA高表达于淋巴结和胃，低表达于心脏、皮肤和十二指肠，在其他14种组织中不表达；SLA-DOA蛋白存在1个信号肽，1个跨膜螺旋，3个保守域，4个O连接的糖基化位点，18个磷酸化位点，位于细胞质的概率是94.1%；系统进化分析表明，在所选择的6个物种中，BMI(猪)与牛的亲缘关系最近。结论：本研究成功克隆了版纳微型猪近交系SLA-DOA基因并进行了生物信息学功能分析和多种组织表达分析，为版纳微型猪近交系的异种器官移植研究奠定基础。

猪白细胞抗原DO座位alpha亚基；版纳微型猪近交系；组织表达；生物信息学

MHC是主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex)的英文简称，位于脊椎动物有核细胞表面，由MHC基因家族(MHC Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因)编码而成，含有多个基因座位，这些基因座位集中分布在脊椎动物染色体的特定区域，主要生物学功能包括5个方面：向T细胞提呈蛋白质抗原、参与个体T细胞库的塑造、参与对免疫应答的遗传控制、诱导自身或同种淋巴细胞反应和参与T细胞分化过程等[1,2]。

猪在消化生理、营养代谢和解剖结构等方面与人体极其相似，是生物医学研究的理想动物模型，更是异种器官移植的首选供体。猪的MHC又被称为SLA(Swine leukocyte antigen)，即猪的白细胞抗原，也可分成Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因，是引发猪→人异种器官移植过程中急性细胞性排斥反应(Acute cellular rejection，ACR)的主要遗传因素[3]。SLA-DOA基因编码猪MHCⅡ类的非经典分子DO的alpha亚基，DO是MHCⅡ类经典分子的分子伴侣，参与MHCⅡ类分子的折叠及空间结构的稳定；通过作为DM分子的抑制剂参与抗原提呈过程[4]。

版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line，BMI)是全球第一个培育成功的大型哺乳动物近交系，因其基因高度纯合、遗传背景清楚，生理学、疾病发生机理和解剖学等方面与人类极为相似，从而可为新药临床前安全性评价、猪基因组计划中的功能基因研究、人类疾病动物模型制作和人类异种器官移植等众多领域提供实验材料和器官供体，具有重要的科研价值和科学意义[5,6]。SLA是由一系列相连锁的基因(单倍体)构成，位于猪的第七号染色体着丝粒的两侧，控制组织器官移植中的排异反应，具有免疫应答和免疫调节等功能[3,7]。随着版纳微型猪近交系克隆猪“福希”、转基因克隆猪(绿色荧光蛋白及leptin瘦蛋白抗肥胖因子)、双基因敲除克隆猪(α 1,3-半乳糖苷酶基因)相继出生，版纳微型猪近交系猪→人移植排斥反应的基础研究是亟待开展的重要研究方向[8-11]。本研究克隆BMISLA-DOA基因，分析其核酸序列特征；通过mRNA的多组织表达谱确定其发挥功能的重要组织；通过功能生物信息学分析预测其蛋白质的功能，为今后进一步深入研究SLA-DOA基因在BMI异种器官移植方面的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料 屠宰10月龄健康版纳微型猪近交系公猪一头，取大脑、小脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉、十二指肠、直肠、淋巴结、胃、睾丸、附睾、前列腺、精囊腺和尿道球腺等19种重要组织样品，液氮速冻，转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.1.2试剂 主要试剂包括RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis、Ex Taq酶和DL2000 Marker等购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。PCR引物由昆明硕擎生物科技有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成 利用RNAiso Plus分别提取组织RNA，用核酸蛋白测定仪检测所提RNA的浓度及纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测完整性，合格样品按反转录试剂盒操作说明书反转录为第一链cDNA保存备用。

1.2.2设计并合成PCR引物 根据GenBank下载的猪SLA-DOAmRNA序列(NM_001185143.1)，利用Oligo 7软件设计F/R特异引物(F:TTAAAACACCAGAGGGCCATG，R:CCGGCAAAATGCATAC AGT)来扩增SLA-DOA基因全长编码区及部分侧翼序列，长度为1 079 bp。

1.2.3PCR扩增反应体系及程序 PCR反应总体系20 μl，包括：13.8 μl ddH2O，2 μl 10×Ex Taq buffer，1.6 μl dNTPs(2.5 mmol/L)、各0.4 μl上下游引物(10 μmol/L)，1.6 μl 淋巴结cDNA模板(50 ng/μl)，0.2 μl 5 U/μl Ex Taq酶。PCR运行程序：98℃ 90 s；94℃ 40 s，57℃ 45 s，72℃ 65 s，共循环35次；最后72℃后延伸10 min；扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送昆明硕擎生物科技有限公司测序。

1.2.4多组织半定量表达分析 以管家基因18SrRNA作为内参，利用半定量RT-PCR技术检测SLA-DOA基因在版纳微型猪近交系公猪的生殖系统(睾丸、附睾、尿道球腺、精囊腺和前列腺)、神经系统(大脑、小脑和下丘脑)、消化系统(胃、十二指肠和直肠)、心脏、皮肤、肝脏、脾脏、肌肉、肺脏、肾脏和淋巴结共19种重要组织的表达情况。扩增18SrRNA基因用到的引物为F：GGACATCTAAGGGCATCACAG，R：AATTCCGATAACGAACGA-GACT；SLA-DOA基因引物使用前面进行基因克隆的引物。PCR反应条件、体系同前，但为了确保PCR处于平台期前的线性扩增范围内，对扩增循环数进行了优化，之后取5 μl扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中稳压130 V电泳40 min，电泳结束后利用凝胶成像仪拍照，使用Quantity one v4.62软件处理胶图。

1.2.5序列确定和生物信息学分析 测序结果利用DNAStar软件中的SeqMan程序进行组装，并进行BLAST在线比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，预测其CDS等结构，并根据所获得的cDNA序列利用DNAStar软件中的EditSeq程序推导出氨基酸序列，并进而预测推导蛋白的分子量(Mw)和等电点(pI)；使用PSortⅡ(http://psort.hgc.jp/)预测蛋白质在细胞中的定位；通过SIM4(http://doua.prabi.fr/software/sim4)和GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)程序分析基因的外显子/内含子结构[12，13]；NCBI上BLAST程序搜索得到家猪(NP_001172072.1)、黄牛(NP_001192849.1)、人(NP_002110.1)、普通猕猴(NP_001181623.1)、大鼠(NP_898874.2)和小鼠(NP_032232.2)的SLA-DOA氨基酸序列，利用DNAStar软件中的MegAlign程序和Clustal X软件与BMI的SLA-DOA的氨基酸序列(AOC89062.1)进行多物种完全比对，参数取默认值，之后利用GeneDoc软件输出；基于多物种同源性比对结果，进一步利用MEGA7.0软件采用邻接法构建系统进化树。利用NCBI服务器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(CDART)工具在线预测蛋白的保守结构域，跨膜螺旋和信号肽分别使用TMHMM和SignalP 4.1 server进行分析；磷酸化和O-糖基化位点分别使用NetPhos 3.1和NetOGlyc 4.0在线服务器进行预测。

2 结果

2.1BMISLA-DOA基因分离和序列分析 以BMI淋巴结cDNA为模板，采用特异性引物F/R进行PCR扩增，电泳检测产物片段的长度为1 079 bp，与预期相符，见图1A。将PCR扩增产物送测序，得到BMI的SLA-DOAmRNA序列，与参考序列比较，发现2个无义突变位点，1个有义突变位点和2个3′UTR区突变位点，见图1B。有义突变发生在编码区的第662位，造成第221位氨基酸从半胱氨酸(普通猪)突变为酪氨酸(BMI)。BMISLA-DOAcDNA长度为1 079 bp，已提交GenBank，登录号为KU705644，含有18 bp的5′UTR区、308 bp的3′UTR区和753 bp的开放阅读框，推测编码250个氨基酸(图1B)，有94.1%概率定位于细胞质中。

2.2BMISLA-DOA基因座基因组结构分析 以BMISLA-DOAcDNA序列作为种子序列，在家猪基因组数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=OGP_9823_10718)中进行BLAST搜索，找到含有该cDNA全长的细菌人工染色体序列：Sus scrofa chromosome 7 clone CH242-254M4(GenBank登录号：CU618315.9)，表明该基因位于猪7号染色体上。随后，利用在线的SIM4和GSDS程序分析其外显子/内含子结构，结果表明该基因长2 946 bp，含有4个外显子和3个内含子，外显子-内含子剪接均符合GT-AG规则(图2)。

图1 BMI SLA-DOA基因RT-PCR扩增产物电泳图谱(A)和序列(B)Fig.1 RT-PCR product (A) and sequence of (B) BMI SLA-DOA geneNote:ATG.Start codon;*.Stop codon;The English letters of upper line,nucleotide sequence;The English letters of lower line,a mino acid sequences;Underlines.primer sequence;frame box indicates mutation nucleotide (compared with NM_001185143.1).

图2 BMI SLA-DOA基因组、mRNA和蛋白保守域结构Fig.2 Genomic organization,mRNA and protein domain structure of BMI SLA-DOA gene

2.3BMI SLA-DOA蛋白功能位点和结构域分析 推测BMI SLA-DOA蛋白质的分子量约27.81 kD，理论等电点为6.48；其中包括4个O-glycosylation位点(Ser103和Thr106、109、116)，9个丝氨酸磷酸化位点(Ser19、59、103、121、170、182、246、247、248)和9个苏氨酸磷酸化位点(Thr16、49、109、153、155、161、178、202、241)(图3)。第1～25位氨基酸为信号肽，第18～240位为跨膜螺旋；第31～110位氨基酸为MHCⅡ alpha功能区，第112～205位为IgC-MHCⅡ alpha区，第203～250位为C1-set C-terminal区(图2和图4)。

2.4SLA-DOA基因同源性比较 用BMI的SLA-DOA氨基酸序列在NCBI中进行同源性搜索，获得了普通猪、黄牛、人、普通猕猴、大鼠和小鼠等动物的该蛋白的氨基酸序列，序列比对表明，BMI与这些物种的相似性依次为99.6%、80.4%、78.8%、78.0%、70.4%和70.0%；这些哺乳动物SLA-DOA蛋白质均含有250个氨基酸，相对于氨基端和羧基末端，中间区域相对保守；构建的这些哺乳动物SLA-DOA蛋白质的系统进化树显示，同为灵长目的人类和普通猕猴聚为一支，同为偶蹄目的BMI、普通猪和黄牛聚为一支，同为啮齿目大鼠和小鼠聚为另一支，符合系统进化的分类标准(图5、6)。

图3 推测的BMI SLA-DOA蛋白的O-糖基化位点(A)与磷酸化位点(B)Fig.3 Predicted O-glycosylation (A) and phosphor-ylation sites (B) of BMI SLA-DOA protein

2.5多组织半定量表达分析 以18SrRNA为内参基因，利用RT-PCR方法检测SLA-DOA基因在成年版纳微型猪近交系公猪的生殖系统(睾丸、附睾、尿道球腺、精囊腺和前列腺)、神经系统(大脑、小脑和下丘脑)、消化系统(胃、十二指肠和直肠)、心脏、皮肤、肝脏、脾脏、肌肉、肺脏、肾脏和淋巴结共19种组织的转录水平，根据获得的琼脂糖凝胶电泳图，利用Quantity One软件分析条带的灰度值，再利用Excel 2007绘制出柱状图，结果表明SLA-DOA基因mRNA在BMI淋巴结和胃中高表达；在心脏、皮肤和十二指肠中低表达；在其他14种组织中几乎不表达，见图7。

图4 推测的BMI SLA-DOA蛋白的信号肽(A)、跨膜螺旋(B)与保守结构域(C)Fig.4 Predicted signal peptide (A),transmembrane structure (B) and conversed domain (C) of BMI SLA-DOA protein

3 讨论

当前器官移植治疗疾病面临的最大问题是供体器官严重缺乏，器官衰竭患者多因无法及时得到供体器官而死亡。异种器官移植已成为目前科学界和医学界公认的解决供体器官短缺的有效途径，猪已被认为是最适合的非灵长类异种器官移植供体[7，8]。版纳微型猪近交系是由曾养志教授和其团队30年来坚持采用连续高度近交加严格选择的科研思路，克服了早期阶段严重近交衰退引起的众多困难，培育成的我国首例哺乳动物(猪)近交系，被誉为猪→人异种器官移植的良好供体[9,14]。为了早日实现BMI→人异种器官移植的临床应用，对其免疫排斥反应机理的研究尤为重要。随着基因敲除技术日益成熟，已基本上可以克服超急性免疫排斥反应，下一关键环节就是解决猪-人异种器官移植急性细胞性排斥ACR。SLA是猪的主要组织相容性复合体，包含三类基因(Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类)，是引起ACR的关键遗传因素[15]。SLAⅡ类基因又称免疫应答基因，位于D区，包含DQ、DR和DO等座位，每个座位分为A基因和B基因，A基因编码座位的alpha链，B基因编码座位的beta链，alpha链和beta链形成的异源二聚体或多聚体可以将外源分子呈递给CD4+T或CD8+T细胞，参与细胞免疫过程[16]。前面我们已进行了BMI的DQ和DR座位的研究[5,17]，本研究首先以BMI淋巴结组织总RNA反转录的cDNA为模板，利用设计的特异引物对SLA-DOA基因进行扩增，获得了1 079 bp的片段。通过对扩增产物测序并拼接，获得BMISLA-DOA基因的cDNA序列(GenBank登录号：KU705644)，CDS区长753 bp，与GenBank数据库中普通猪的SLA-DOA序列(登录号：NM_001185143.1)比较，共发现5个碱基差异位点，2个无义突变位点，1个有义突变位点和2个3′UTR区突变位点。有义突变发生在DOA编码区的第662位，造成第221位氨基酸从半胱氨酸Cys突变为酪氨酸Tyr。两个Cys通过它们侧链上的-SH基氧化形成二硫键，二硫键是蛋白质形成特定空间结构的重要化学键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。通过多物种氨基酸比对发现普通猪、人、猕猴、黄牛、大鼠和小鼠在第221位氨基酸均为Cys，且221位氨基酸位于跨膜螺旋和C1-SETC末端保守结构域内，推测此氨基酸的突变可能会影响SLA-DOA蛋白在BMI正常功能，但还需要进一步研究才能确定。

分析BMI SLA-DOA氨基酸结构和功能表明，该蛋白的氨基酸序列含有1个跨膜螺旋，多个丝氨酸、苏氨酸磷酸化位点以及O连接糖基化位点结构，含有两个alpha区(MHCⅡ和IgC-MHCⅡ)和1个C1-set C-terminal区，这是MHCⅡ类分子alpha亚基的共有结构，与其他哺乳动物的结果类似。与其他动物的氨基酸序列比较发现，BMI SLA-DOA与哺乳动物对应蛋白的同源性在70%以上，说明该基因在进化过程中具有较高的保守性。多物种BMI SLA-DOA氨基酸序列构建的系统进化树表明同为灵长目的人类和猕猴聚为一支，同为偶蹄目的BMI、普通猪和黄牛聚为一支，同为啮齿目大鼠和小鼠聚为另一支，符合系统进化的分类标准。以18SrRNA为内参对照校正的多组织表达谱分析表明SLA-DOA基因在BMI的淋巴结和胃中高表达。淋巴结组织是机体重要的免疫器官，参与细胞免疫和体液免疫，间接表明了SLA-DOA基因可能参与了BMI的免疫应答过程；胃是重要的消化器官，SLA-DOA基因在BMI胃中高表达的原因需要进一步研究。

综上所述，该研究利用RT-PCR方法成功分离了版纳微型猪近交系SLA-DOA基因的全长编码区序列，采用半定量RT-PCR确定了其在BMI 19种组织中的表达情况，并进一步对其编码的蛋白质进行了功能生物信息学分析，研究结果将为深入研究SLA-DOA基因在猪中的功能奠定基础。

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[收稿2016-11-21 修回2016-12-14]

(编辑 倪 鹏)

Cloning,mRNAexpressionandproteinfunctionalbioinformaticsanalysisofSLA-DOAinBannamini-piginbredline

WANGPei,WANGShu-Yan,HUOJin-Long,LILuo-Gang,ZHANGYong-Yun,LIWei-Zhen,ZHUHong-Tao,YAOMao-Dong.KeyLaboratoryofBannaMini-PigInbredLineofYunnanProvince,YunnanAgriculturalUniversity,Kun-ming650201,China

Objective:To clone swine leukocyte antigen,class II,DO alpha (SLA-DOA) gene from Banna mini-pig inbred line (BMI) and detect its mRNA expression level in 19 important tissues.Methods:The complete cDNA sequence ofSLA-DOAgene was cloned by RT-PCR method from BMI and the mRNA expression pattern in BMI important tissues was examined by semi-quantative RT-PCR method.Nucleotide and protein sequences ofSLA-DOAwere used to carry out bioinformatics analysis and construct the phylogenetic tree.Results:The cDNA length of BMISLA-DOAwas 1 079 bp,which encoded a protein of 250 amino acids with molecular weight (Mw) 27.81 kD,and isoelectric point (pI) 6.48.Genome structure analysis showed it localized to Sus scrofa chromosomes 7 and consisted of four exons and three introns.Semi-quantitative expression analysis showed that SLA-DOA gene expressed highly in the lymph nodes and stomach;weakly in the heart,skin and duodenum and none in other 14 tissues.Functional bioinformatics analysis indicated that SLA-DOA protein contained one signal peptide,one transmembrane region,three conserved domains,four O-GlcNAc glycosylation sites,18 potential phosphorylation sites and to be located in the cytoplasm with 94.1% certainty.Phylogenetic analysis demonstrated that BMI (pig) had the closest relationship with cattle.Conclusion:This study have successfully cloned theSLA-DOAgene of Banna mini-pig inbred line,performed bioinformatics analysis and tissue expression profile analysis.It will provide a basis for the studies of BMI xenotransplantation.

SLA-DOA;Banna mini-pig inbred line;Tissue expression;Bioinformatics

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.014

①本文受国家自然科学基金项目(31160439,31660650,31660637,31460580)和云南省应用基础研究计划项目(2016FB046，2016FD027)资助。

②共同第一作者。

③云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心，昆明 650201。

④云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201。

王 配(1987年-)，女，博士，实验师，主要从事异种移植免疫排斥机制方面的研究，E-mail：peipei99999@126.com。

及指导教师：霍金龙(1975年-)，男，博士，副教授，主要从事动物分子遗传学方面的研究,E-mail:jinlonghuo973@163.com。

S852.4

A

1000-484X(2017)06-0873-06