miR-346在鼻咽癌中的表达及生物学功能①

蒋成义 汪洪涛 江 涛 许亚佳 夏 林

(蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，蚌埠233004)

miR-346在鼻咽癌中的表达及生物学功能①

蒋成义 汪洪涛②江 涛 许亚佳 夏 林

(蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，蚌埠233004)

目的：探讨miR-346在鼻咽癌中的表达及在鼻咽癌中的生物学功能。方法：收集63例鼻咽癌组织以及34例鼻咽部非癌组织标本，Real-time PCR检测组织和6株人鼻咽癌细胞系及1株人正常鼻咽部永生化上皮细胞株NP69中miR-346表达量，选取人鼻咽癌细胞系中表达量居中的两种细胞系，并转染miR-346 inhibitor，设置对照组(NC组)并转染阴性对照质粒，Real-time PCR检测两种细胞系转染miR-346 inhibitor和对照组miR-346表达量，细胞增殖、凋亡分别采用Brdu-ELISA和流式细胞术检测，Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭。结果：与鼻咽非癌组织比较，鼻咽癌组织中miR-346表达量显著升高(P=0.000)；以正常人鼻咽部上皮细胞NP69比较，各鼻咽癌细胞株中miR-346相对表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。选择6种鼻咽癌细胞株中miR-346表达量居中的两种，分别为CNE-1和CNE-2，转染miR-346 inhibitor后，两种鼻咽癌细胞株miR-346相对表达量均显著降低，与NC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。两种鼻咽癌细胞转染miR-346 inhibitor下调miR-346表达后鼻咽癌细胞的增殖受到抑制，均在转染第3天差异具有统计学意义(P<0.05)。下调miR-346表达后鼻咽癌细胞CNE-1和CNE-2的凋亡显著增加，迁移细胞数和侵袭细胞数显著降低，与NC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-346在鼻咽癌中高表达，下调miR-346表达会抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，miR-346可能作为一种癌基因在鼻咽癌的发生和发展中发挥重要的作用。

miR-346；鼻咽癌；增殖；凋亡；迁移；侵袭

鼻咽癌起源于鼻咽部上皮细胞，是常见的头颈部恶性肿瘤。目前已知的鼻咽癌致病因素包括遗传易感性、饮食和环境因素、EB病毒感染[1]。鼻咽癌具有早期远处转移和高度局部转移的特征，且起病隐匿，易复发，虽然以调强放射治疗技术为主的放化疗综合治疗可以提高鼻咽癌的局控率，但鼻咽癌的5年生存率仍仅维持在70%[2]。深入了解鼻咽癌的癌变分子机制有助于提高鼻咽癌的早期诊断准确率，并寻找到其他更有效的治疗方法从而延长生存期，改善患者预后。

microRNA简称miRNA，是非编码RNA分子的一种，长度为19～25 nt。miRNA能够与下游基因mRNA的3′端非编码区(3′-UTR)特异性结合影响mRNA的降解和翻译，从而参与调控细胞的生长、分化、增殖等多种生理及病理过程[3]。miRNA与肿瘤的关系是近年来研究的热点，研究发现超过50%的miRNA基因定位在与肿瘤相关的脆性位点[4]。miRNA与肿瘤的生长、转移和血管新生等密切相关[5]，目前已经在多种肿瘤中检测到miRNA 的异常表达[4，5]。miR-346是miRNA家族中的一种，已经有研究发现miR-346在炎性肠道疾病[6]和甲状腺肿[7]等的发生中具有重要作用。新近研究发现，miR-346与宫颈癌的发生也有关[8]，miR-346在鼻咽癌中的表达及生物学功能尚不清楚，本研究旨在探讨miR-346在鼻咽癌中的表达，采用细胞瞬时转染技术认为干预鼻咽癌细胞中miR-346表达量，分析miR-346表达量改变对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等恶性肿瘤生物学特征的影响。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，CO2培养箱购自美国Forma公司，dNTP Mix、Taq DNA Polymerase、GeneRulerTM100 bp DNA Ladder、QIAqucik Gel Extraction Kit、质粒小提试剂盒、细胞裂解液均购自美国Fermentas公司；胰蛋白酶购自美国DIBCO公司；碘化丙啶、超速离心机购自美国Sigma公司；PCR仪购自美国Bio-Rad公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自上海赛默飞世尔公司，抗BrdU 抗体、miR-346抑制物(Inhibitor)以及阴性对照质粒均购自上海吉玛生物公司；二甲基亚砜(DMSO)购自碧云天生物技术公司；基质胶(Matrigel)购自美国BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1组织获取和细胞培养 63例鼻咽癌组织以及34例鼻咽部非癌组织均来自安徽省蚌埠医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科。所有标本均为鼻咽部活检取得，并经病理学检查确诊，入选者均知情同意，此前均未接受放化疗治疗，组织获取后置于液氮中保存。6株人鼻咽癌细胞系HONE1、6-10B、CNE-1、C666-1、CNE-2、SUNE-1以及1株人正常鼻咽部永生化上皮细胞株NP69购自上海中科院细胞所。细胞均培养于10%胎牛血清培养基中，培养条件为：5%CO2、37℃、饱和湿度细胞培养箱，每隔48～72 h，用0.25%的胰酶消化对数期细胞并进行细胞传代，细胞传代2～3代用于后续实验。

1.2.2实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR) 取冻存的组织约0.1 g，置于冰冻的研钵中加液氮充分研磨成细粉，放入离心管并加入裂解液，离心后静置；用预冷的PBS洗涤细胞加入裂解液，静置10 min至细胞裂解完全。收集细胞裂解液并按照试剂盒提取细胞和组织中总RNA，配制miRNA反转录反应液对总RNA中的miRNA进行反转录。冰上配制miR-346的qPCR反应液，混匀后加入PCR反应管中，离心并将混合物加入多孔板，多孔板置于PCR仪中，两步法进行退火反应：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，扩增40个循环。绘制光谱和溶解曲线，软件分析样品的Ct值，以U6为内参，2-ΔΔCt法计算miR-346表达量。

1.2.3质粒转染 为了研究miR-346的生物学功能，本研究选取人鼻咽癌细胞系中表达量居中的两种细胞系。另外，由于鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系中miR-346均高表达，因此采取miR-346 inhibitor进行转染。miR-346 inhibitor为miR-346抑制物，是一种慢病毒载体，可以通过感染肿瘤细胞将外源的shRNA或外源基因整合并抑制miR-346表达，由上海吉玛生物公司合成，序列：上游：5′-TTACTCCAGAGGGCGTCACTCATGTTCAAGAGACATGAGTGAC-GCCCTCTGGAGTATTTTTTC-3′下游：5′-TCGAGA-AAAAATACTCCAGAGGGGCGTCACTCATGTCTCTT-GAACATGAGTGACGCCCTCTGGAGTAA-3′。具体方法为：将细胞种植于多孔板中，取两个EP管，分别加入5 μl LipofectamineTM2000+100 pmol miR-346 inhibitor和5 μl LipofectamineTM2000+阴性质粒(对照组)，加入培养基至终体积为2 ml。取转染后细胞重复Real-time PCR实验。

1.2.4Brdu-ELISA 对数生长期细胞，胰腺酶消化后制备细胞单悬液，控制浓度为1×105个/ml，加入多孔板，每孔加入1 ml，细胞转染后加入BrdU标记液，室温孵育4 h后加入抗BrdU 抗体，PBS洗涤3次，加入底物液显色并终止反应。每组设5个副孔用于测定转染后1～5 d细胞增殖情况。采用酶标仪测定450 nm波长处的吸光值。

1.2.5流式细胞术 将转染48 h后的细胞用PBS洗涤，超速离心机离心后弃上清液，孵育缓冲液洗涤后离心，100 μl Binding buffer重悬细胞，加入PI，避光4℃孵育20 min并不时振动。制备单细胞悬液，浓度为1×105个/ml，采用流式细胞仪测定细胞凋亡百分比。

1.2.6Transwell小室实验 Matrigel预先放入4℃冰箱融化过夜，无血清DMEM培养液稀释Matrigel至1 mg/ml，每孔加入100 μl稀释液至Transwell小室，包被1 h后洗涤。分别向铺设(侵袭试验)和未铺设(迁移试验)Matrigel的培养嵌室上部加入转染24 h后的细胞悬液，每孔加入100 μl约2.5×104个，底部为正常培养基，5%CO2、37℃常规培养24 h后吸去嵌室内的液体并用聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS漂洗，倒置显微镜下选取5个视野计算细胞数。

2 结果

2.1组织和各细胞株中miR-346表达量比较 与鼻咽非癌组织比较，鼻咽癌组织中miR-346表达量显著升高(3.124±0.832 vs 5.993±1.139,t=2.493,P=0.000，图1A)；与正常人鼻咽部上皮细胞NP69比较，各鼻咽癌细胞株中miR-346相对表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，图1B)。

2.2转染miR-346 inhibitor对两种鼻咽癌细胞株miR-346表达量的影响 选择6种鼻咽癌细胞株中miR-346表达量居中的两种，分别为CNE-1和CNE-2，转染miR-346 inhibitor后，CNE-1(图2A)和CNE-2(图2B)两种鼻咽癌细胞株miR-346相对表达量均显著降低，与NC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 组织和各细胞株中miR-346表达量比较Fig.1 miR-346 expression in tissue and cells of naso-pharyngeal carcinomaNote:*.P<0.05.

2.3下调miR-346表达对鼻咽癌细胞增殖的影响 Brdu-ELISA检测结果显示，CNE-1(图3A)和CNE-2(图3B)两种鼻咽癌细胞转染miR-346 inhibitor下调miR-346表达后鼻咽癌细胞的增殖受到抑制，在第3天差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4下调miR-346表达对鼻咽癌细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，下调miR-346表达后CNE-1和CNE-2两种鼻咽癌细胞的凋亡显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5下调miR-346表达对鼻咽癌细胞迁移的影响 由图5可知，下调miR-346表达后CNE-1和CNE-2两种鼻咽癌细胞的迁移细胞数均明显低于NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.6下调miR-346表达对鼻咽癌细胞侵袭的影响 由图6可知，下调miR-346表达后CNE-1和CNE-2两种鼻咽癌细胞的侵袭细胞数均明显低于NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 转染miR-346 inhibitor降低鼻咽癌细胞株miR-346表达Fig.2 Expression of miR-346 reduced after transfection miR-346 inhibitor in nasopharyngeal carcinoma cell linesNote:*.P<0.05.

图3 下调miR-346表达抑制鼻咽癌细胞增殖Fig.3 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed growth of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

图4 下调miR-346表达促进鼻咽癌细胞凋亡Fig.4 Down-regulate of miR-346 significantly promoted apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

图5 下调miR-346表达抑制鼻咽癌细胞迁移Fig.5 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed migration of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

图6 下调miR-346表达抑制鼻咽癌细胞侵袭Fig.6 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed invasion of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

3 讨论

作为一种头颈部常见恶性肿瘤，鼻咽癌主要发生于鼻咽顶的侧壁和前壁，能够早期侵犯颅底和出现颈部淋巴结转移。随着诊疗技术水平的提高，早期鼻咽癌经过规范化综合治疗后5年生存率可超过70%，但晚期鼻咽癌的5年生存率不足30%。目前临床对于鼻咽癌的早期诊断以及预后评估尚缺乏特异性生物学标志物，了解鼻咽癌发生发展的分子机制并找寻差异性表达的预测分子标志物，通过研究其在鼻咽癌中的生物学功能，从而有望提高鼻咽癌的诊治水平，延长生存期，改善患者预后。

目前肿瘤常见的生物学行为包括潜力无限的复制能为、抗生长信号的不敏感、抵抗细胞死亡、组织浸润和转移、基因组的稳定和突变等[9]，但肿瘤究竟是如何发生和发展的，其中的具体机制仍然不明确。一般而言，肿瘤是一种基因疾病，致癌因素引起基因的改变，造成对肿瘤生长的失调。新近研究发现，除了常见的蛋白编码基因，一些非编码的基因与肿瘤的关系也越来越密切[10]。miRNA是一类非编码RNA，在进化上高度保守，通过特异性结合下游多个靶基因mRNA的3′-UTR区，影响转录后基因水平。miRNA参与了包括细胞增殖、分化、生长、发育、凋亡等几乎所有的生命活动，与包括肿瘤在内的人类大多数疾病密切相关，而在肿瘤的发生和发展中，miRNA扮演着促癌基因或者抑癌基因的角色[11]。

miRNA表达改变受多种因素的影响，包括基因重排、染色体异常、基因突变和基因丢失。miRNA表达异常会影响受其调控的mRNA，从而调控编码蛋白的表达。miRNA与肿瘤的关系，同一种miRNA或者同一个家族miRNA可以参与多种肿瘤的发生[12-14]。同一种miRNA在不同的肿瘤中能发挥抑癌或者癌基因不同的作用[15，16]。在同一种肿瘤中可以有多种miRNA表达异常[17，18]。

miRNA正是通过这种全方位多层次的网络调控系统对肿瘤细胞的生长、分化、增殖、凋亡、侵袭和转移进行调控，参与包括鼻咽癌在内的几乎所有恶性肿瘤的发生和发展。目前已知有超过30多种miRNA参与鼻咽癌的发病，而关于miR-346在鼻咽癌中的表达及生物学功能尚不清楚。本研究通过Real-time PCR检测并比较了鼻咽癌组织和鼻咽部非肿瘤组织，6种鼻咽癌细胞系和正常人鼻咽部上皮细胞中miR-346表达量，结果发现鼻咽癌组织miR-346表达量高于鼻咽部非肿瘤组织，6种鼻咽癌细胞系miR-346表达量高于正常人鼻咽部上皮细胞。说明miR-346在鼻咽癌中高表达，可能发挥癌基因作用。为了进一步进行验证，采用细胞瞬时转染技术，通过转染miR-346 inhibitor抑制鼻咽癌细胞中miR-346，分别对肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭四种生物学行为进行了观察，结果发现，下调miR-346表达会抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡。以往研究认为[7]，miR-346能够调节卵泡辅助T细胞(Tfh)参与包括甲状腺功能亢进在内的自身免疫性疾病中，miR-346在甲亢患者血清中呈低表达，且与CD4(+)CXCR5(+) T细胞呈负相关，而上调miR-346表达会导致CD4(+)CXCR5(+) T细胞衰减。近年来miR-346与肿瘤的关系逐渐被发现和重视，Guo和他的同事[8]对miR-346在宫颈癌中的作用进行了研究，结果发现miR-346在宫颈癌中高表达，能够促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭，且能够增强调节蛋白Argonaute2(Ago2)的表达。本研究与Guo等的研究得到相似的观点，认为miR-346在肿瘤的发生和发展中扮演着癌基因的作用。

综上所述，本研究结果初步表明，miR-346作为一种癌基因参与鼻咽癌的发生和发展，人为干预miR-346表达会影响鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为。本研究尚存在以下不足：首先，未进行体内动物实验进一步验证miR-346在鼻咽癌中的生物学功能；其次，未对miR-346在鼻咽癌中发挥作用的靶基因进行预测和验证，这将会在今后研究的中进一步改善。

[1] Dawson CW,Port RJ,Young LS.The role of the EBV-encoded latent membrane proteins LMP1 and LMP2 in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC)[J].Semin Cancer Biol,2012,22(2):144-153.

[2] Atighechi S,Ahmadpour Baghdadabad MR,Mirvakili SA,etal.Human papilloma virus and nasopharyngeal carcinoma:pathology,prognosis,recurrence and mortality of the disease[J].Exp Oncol,2014,36(3):215-216.

[3] Sperber H,Beem A,Shannon S,etal.miRNA sensitivity to Drosha levels correlates with pre-miRNA secondary structure[J].RNA,2014,20(5):621-631.

[4] Zhang J,Zhao H,Gao Y,etal.Secretory miRNAs as novel cancer biomarkers[J].Biochim Biophys Acta,2012,1826(1):32-43.

[5] Rocci A,Hofmeister CC,Pichiorri F.The potential of miRNAs as biomarkers for multiple myeloma[J].Expert Rev Mol Diagn,2014,14(8):947-959.

[6] Chen Y,Du J,Zhang Z,etal.MicroRNA-346 mediates tumor necrosis factor α-induced downregulation of gut epithelial vitamin D receptor in inflammatory bowel diseases[J].Inflamm Bowel Dis,2014,20(11):1910-1918.

[7] Chen J,Tian J,Tang X,etal.MiR-346 regulates CD4+CXCR5+T cells in the pathogenesis of Graves′ disease[J].Endocrine,2015,49(3):752-760.

[8] Guo J,Lv J,Liu M,etal.miR-346 up-regulates argonaute 2 (AGO2) protein expression to augment the activity of other microRNAs (miRNAs) and contributes to cervical cancer cell malignancy[J].J Biol Chem,2015,290(51):30342-30350.

[9] Gadbail AR,Mankar Gadbail MP,Hande A,etal.Tumor angiogenesis:role in locally aggressive biological behavior of ameloblastoma and keratocystic odontogenic tumor[J].Head Neck,2013,35(3):329-334.

[10] Yu W,Qiao Y,Tang X,etal.Tumor suppressor long non-coding RNA,MT1DP is negatively regulated by YAP and Runx2 to inhibit FoxA1 in liver cancer cells[J].Cell Signal,2014,26(12):2961-2968.

[11] Tutar Y.miRNA and cancer;computational and experimental approaches[J].Curr Pharm Biotechnol,2014,15(5):429.

[12] Hu CB,Li QL,Hu JF,etal.miR-124 inhibits growth and invasion of gastric cancer by targeting ROCK1[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(16):6543-6546.

[13] Wan HY,Li QQ,Zhang Y,etal.MiR-124 represses vasculogenic mimicry and cell motility by targeting amotL1 in cervical cancer cells[J].Cancer Lett,2014,355(1):148-158.

[14] Feng T,Shao F,Wu Q,etal.miR-124 downregulation leads to breast cancer progression via LncRNA-MALAT1 regulation and CDK4/E2F1 signal activation[J].Oncotarget,2016,7(13):16205-16216.

[15] Xie H,Lee L,Scicluna P,etal.Novel functions and targets of miR-944 in human cervical cancer cells[J].Int J Cancer,2015,136(5):E230-E241.

[16] Christensen LL,Tobiasen H,Holm A,etal.MiRNA-362-3p induces cell cycle arrest through targeting of E2F1,USF2 and PTPN1 and is associated with recurrence of colorectal cancer[J].Int J Cancer,2013,133(1):67-78.

[17] Tang H,Deng M,Tang Y,etal.miR-200b and miR-200c as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J].Clin Cancer Res,2013,19(20):5602-5612.

[18] Zhu ED,Li N,Li BS,etal.miR-30b,down-regulated in gastric cancer,promotes apoptosis and suppresses tumor growth by targeting plas minogen activator inhibitor-1[J].PLoS One,2014,9(8):e106049.

[收稿2016-11-03 修回2017-01-05]

(编辑 张晓舟)

ExpressionandbiologicalfunctionsofmiR-346innasopharyngealcarcinoma

JIANGCheng-Yi,WANGHong-Tao,JIANGTao,XUYa-Jia,XIALin.DepartmentofOtorhinolaryngology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China

Objective:To explore the expression and biological functions of miR-346 in nasopharyngeal carcinoma.Methods:63 cases nasopharyngeal carcinoma tissue and 34 cases nasopharyngeal non-cancer tissues were collected,the miR-346 expression were detected by Real-time PCR between nasopharyngeal carcinoma tissue and nasopharyngeal non-cancer tissues,6 strains of human nasopharyngeal carcinoma cell lines and 1 strain of normal nasopharyngeal epithelial cell immortalized NP69.Two cell lines with middle expression levels in human nasopharyngeal carcinoma cells lines were selected,and transfected into miR-346 inhibitor，the control group (NC group) were with negative control plasmid transfection,miR-346 expression in two groups were detected by Real-time PCR,the proliferation,apoptosis were detected by Brdu-ELISA and flow cytometry,the migration and invasion were detected by Transwell Chambers experiments.Results:Compared with the nasopharyngeal non-cancer tissues,the miR-346 expression in nasopharyngeal carcinoma tissues was significantly increased (P=0.000);compared with the normal nasopharyngeal epithelial cells NP69.the miR-346 expression in human nasopharyngeal carcinoma cell lines was significantly increased (P<0.05).The CNE-1 and CNE-2 were chose,after the miR-346 inhibitor transfection,the miR-346 expression were significantly lower compared with NC group,the difference was statistically significant (P<0.05).The proliferation of two kinds of nasopharyngeal carcinoma cell CNE-1 and CNE-2 were restrained after transfection,the difference showed statistically significant 3 days after transfection (P<0.05).The apoptosis increased significantly,and the migration cell numbers and invasion cell numbers decreased significantly compared with NC group,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion:miR-346 is overexpression in nasopharyngeal carcinoma,down-regu-lation of miR-346 inhibits the proliferation,migration,invasion,promotes the apoptosis,miR-346 may act as a oncogene and play an important role in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma.

miR-346;Nasopharyngeal carcinoma;Proliferation;Apoptosis;Migration;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.006

①本文受2015年度安徽省高等学校自然科学研究一般项目(No.KJ2015B019by)资助。

②蚌埠医学院免疫学教研室，蚌埠233030。

蒋成义(1975年-)，男，硕士，副主任医师，副教授，主要从事耳鼻咽喉头颈外科肿瘤诊治研究，E-mail：jiangchengyi23@163.com。

R739.63

A

1000-484X(2017)06-0833-05