Smad1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌细胞迁移能力的影响研究①

王 欣 李宜炯 庞 超 张瑞华 杨艳红 朱振龙 王政民

(河北医科大学第一医院病理科，石家庄050031)

Smad1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌细胞迁移能力的影响研究①

王 欣 李宜炯②庞 超 张瑞华 杨艳红 朱振龙 王政民

(河北医科大学第一医院病理科，石家庄050031)

目的：研究Smad1在胃腺癌组织中的表达及对胃腺癌细胞迁移能力的影响。方法：提取收集的胃腺癌组织及对应的癌旁组织中的蛋白，Western blot检测Smad1的表达水平。以胃腺癌细胞HGC-27为研究对象，细胞转染过表达Smad1的载体(p-EGFP-C1/Smad1)和Smad1小干扰RNA(Smad1 siRNA)，同时转染p-EGFP-C1和 siRNA control为对照。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt的表达水平。Akt信号通路抑制剂LY294002(20 μg/ml)作用于胃腺癌细胞HGC-27，MTT检测细胞增殖情况，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表达水平。结果：胃腺癌组织中Smad1的水平明显低于癌旁组织(P<0.01)。p-EGFP-C1/Smad1组细胞存活率和迁移率均明显低于p-EGFP-C1组(P<0.01)。Smad1 siRNA组细胞存活率和迁移率均明显高于siRNA control组(P<0.01)。 p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA组细胞中Akt蛋白表达水平没有变化。p-EGFP-C1/Smad1组细胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表达水平明显低于p-EGFP-C1组(P<0.01)。Smad1 siRNA组细胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表达水平明显高于siRNA control(P<0.01)。胃腺癌细胞与Akt信号通路抑制剂作用后细胞增殖和迁移趋势与p-EGFP-C1/Smad1组一致。结论：Smad1在胃腺癌组织中低表达。Smad1能够抑制胃腺癌细胞增殖和迁移，作用机制与Akt信号通路有关。

胃腺癌；Akt信号通路；增殖；迁移

据统计，在世界范围内每年有超过100万的新增胃癌患者，有超过80万患者死于胃癌，其中中国的新增胃癌患者和死亡人数占三分之一[1]。在中国，胃癌的发病率和致死率在全部恶性肿瘤中位居第3位，男性的发病率高于女性，农村高于城市[2]。胃癌中有95%属于胃腺癌。胃腺癌严重威胁着人类的生命健康。

Smad是一种重要的信号转导因子[3]。Smad1是Smad受体活化类型，参与调节细胞的生长、分化、凋亡等过程，在机体免疫系统中也有重要作用[4,5]。近年来的研究表明，Smad1在结直肠癌、舌鳞癌、子宫内膜癌等多种癌症中表达下调[6,7]。本研究中运用Western blot检测胃腺癌组织中Smad1的水平，并探讨Smad1对胃腺癌细胞增殖和迁移能力的影响，以期为进一步研究胃腺癌的发病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织及细胞 选取2011年10月～2013年2月在我院确诊切除的胃腺癌患者胃腺癌组织及距离肿块5 cm以上的癌旁组织各56例，平均年龄(62.14±10.47)岁，其中女性20例，男性36例。人胃腺癌细胞HGC-27由河北医科大学病理教研室提供。

1.1.2主要仪器及试剂 p-EGFP-C1/Smad1、 p-EGFP-C1由本实验室保存；DMEM培养基、青链霉素、胰蛋白酶均购自于美国Sigma；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物科技有限公司；MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt、Smad1、β-actin单克隆抗体均购自上海酶联生物研究所；CO2培养箱购自美国Thermo。

1.2方法

1.2.1Western blot检测胃癌组织中的Smad1水平 收集56例胃腺癌组织和癌旁组织，剪碎后，加入到组织匀浆器中，加入组织裂解液，放在冰上裂解30 min后，14 000 r/min离心20 min，吸取蛋白上清液到EP管中。取蛋白样品，加入Loading buffer混合后，放在100℃的孵育器中煮沸3 min。将变性蛋白样品加入到上样孔中，电泳初始电压为80 V，观察溴酚蓝进入分离胶后，将电压调整为120 V至电泳结束。取出蛋白凝胶，洗涤后，放在转印缓冲液中浸泡10 min。取出PVDF膜，100 mA恒流将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭后，加入一抗(500倍稀释)、二抗(1 000倍稀释)依次反应后，滴加显色液，显影定影后，以β-actin为内参，分析目的蛋白表达率。

1.2.2细胞培养 取出保存在-80℃的胃腺癌细胞HGC-27，37℃完全融化后，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，在细胞中加入含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，充分混合，接种到细胞培养瓶中，放在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。倒置显微镜下观察细胞密度超过85%时，弃掉细胞培养液，加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，离心后，用细胞培养液悬浮细胞，根据实验要求接种到细胞培养瓶中培养。

1.2.3细胞转染 取培养至对数生长期的胃腺癌细胞，加入胰蛋白酶消化后，接种到6孔细胞培养板中培养过夜，观察细胞融合度达到75%时，更换细胞培养液为不含有胎牛血清的不完全培养液，放在37℃孵育1 h。用Lipofectamine 2000将过表达Smad1的载体(p-EGFP-C1/Smad1)和Smad1小干扰RNA(Smad1 siRNA)转染至胃腺癌细胞中，同时转染p-EGFP-C1和 siRNA control为对照。放在37℃培养48 h后，Trizol法提取细胞中的总蛋白，Western blot检测细胞中Smad1水平。

1.2.4MTT检测细胞增殖 转染后的胃腺癌细胞，经胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，用细胞培养液悬浮后，接种到96孔细胞培养板中，每孔中加入细胞个数为2×104个，放在CO2培养箱中培养48 h后。在细胞中加入浓度为5 mg/ml 的MTT溶液，放在CO2培养箱中孵育反应4 h。同时设置空白组，空白组中不加细胞。为了提高实验的准确性，每组设置8个复孔。吸除上清液，加入DMSO溶液150 μl，放置于避光条件下反应10 min，观察结晶物完全溶解后，酶标仪检测每孔的吸光度。计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)-(对照组OD值-空白组OD值)。

1.2.5细胞划痕实验检测细胞迁移 取转染后的胃腺癌细胞，接种到细胞培养瓶中，放在37℃，5% CO2培养箱中培养过夜，观察细胞完全贴壁后，弃上清液，用移液枪枪头垂直的在长满细胞的培养瓶壁上划出一条细痕，加入PBS洗涤两次将划出的细胞洗掉。放在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。倒置显微镜下观察细胞划痕宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率=细胞迁移距离/细胞划痕宽度。

1.2.6Western blot检测细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平 转染后的胃腺癌细胞培养48 h后，收集细胞，Trizol法提取细胞蛋白，Western blot检测细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平。步骤同1.2.1。

1.2.7阻断Akt信号通路对胃腺癌细胞增殖迁移影响 培养至对数生长期的胃腺癌细胞，与20 μg/ml的Akt信号通路抑制剂LY294002作用48 h后记为抑制剂组，同时设置对照组，对照组不加入抑制剂LY294002。MTT检测细胞增殖情况，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平。同1.2.1、1.2.4、1.2.5。

2 结果

2.1胃腺癌组织中Smad1蛋白表达水平结果 Western blot检测了56例胃腺癌组织和癌旁组织中Smad1蛋白水平。结果发现，胃癌组织中Smad1蛋白相对表达水平约为(0.18±0.05)，而癌旁组织中Smad1蛋白相对表达水平约为(0.46±0.06)。Smad1蛋白在胃腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织，差异有显著统计学意义(P<0.01 )，见图1。

2.2转染后细胞中Smad1蛋白表达水平结果 胃腺癌细胞转染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、 siRNA control、Smad1 siRNA后，培养48 h，Western blot检测细胞中Smad1蛋白表达水平。结果显示，p-EGFP-C1/Smad1组细胞中Smad1的水平明显高于p-EGFP-C1，差异有显著统计学意义(P<0.01)。Smad1 siRNA组细胞中Smad1的水平明显低于siRNA control，差异有显著统计学意义(P<0.01)，见图2、表1。

图1 Western blot检测胃腺癌组织中Smad1蛋白表达结果Fig.1 Expression of Smad1 in gastric adenocarcinoma tissues by Western blot

图2 Western blot检测转染后细胞中Smad1蛋白水平结果图Fig.2 Expression of Samd1 in gastric adenocarcinoma cells transfected by Western blotNote:1 .p-EGFP-C1；2.p-EGFP-C1/Smad1；3.siRNA control；4.Smad1 siRNA.

2.3Smad1对胃腺癌细胞增殖迁移影响结果 转染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA后，MTT检测48 h的细胞存活情况，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果显示，p-EGFP-C1/Smad1组细胞存活率和迁移率明显低于p-EGFP-C1组，差异有显著统计学意义(P<0.01)，Smad1 siRNA组细胞存活率和迁移率明显高于siRNA control，差异有显著统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.4Smad1对胃腺癌细胞MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表达影响 转染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA后，Western blot检测48 h细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白水平。结果显示，p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA con-trol、Smad1 siRNA组细胞中Akt蛋白表达水平没有变化。p-EGFP-C1/Smad1组细胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表达水平明显低于p-EGFP-C1组，差异显著(P<0.01)。Smad1 siRNA组细胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表达水平明显高于siRNA control，差异显著(P<0.01)。见图3、表2。

表1 转染后细胞中Smad1蛋白表达率、细胞存活率和细胞迁移率

Note：1)P<0.01 vs p-EGFP-C1；2)P<0.01 vs siRNA control.

图3 Western blot检测转染后细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表达结果Fig.3 Expression of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in gastric adenocarcinoma cells transfected by Western blotNote:1.p-EGFP-C1；2.p-EGFP-C1/Smad1；3.siRNA control；4.Smad1 siRNA.

表2 转染后细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表达率

Note：1)P<0.01 vs p-EGFP-C1；2)P<0.01 vs siRNA control.

表4 阻断Akt信号通路后细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表达率

Note：1)P<0.01 vs matched group.

2.5阻断Akt信号通路对胃腺癌细胞增殖迁移影响结果 胃腺癌细胞与20 μg/ml的Akt信号通路抑制剂LY294002作用48 h后，MTT检测细胞存活率，细胞划痕实验检测细胞迁移率，Western blot检测细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表达水平。结果显示，抑制剂组细胞存活率和迁移率明显低于对照组，差异有显著统计学意义(P<0.01)。抑制剂组细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt水平明显低于对照组，差异显著(P<0.01)。见图4、表3、4。

3 讨论

Smads蛋白家族含有9个成员，其分子量大约为42～60 kD。Smad由高度保守的氨基酸、羧基端及含有脯氨酸的中间连接区组成[8]。Smad1由465个氨基酸组成，参与转化生长因子-β信号通路的转导，对组织胚胎发育、机体免疫系统、组织修复及细胞生长等都具有重要作用[9,10]。 Smad1在糖尿病、癌症等疾病的发生发展过程中也具有调控功能[11]。有研究表明，Smad1在肺癌、结直肠癌、垂体腺瘤等肿瘤中表达异常[12]。过表达Smad1后的小鼠垂体瘤细胞增殖能力明显减弱，细胞周期阻滞在S期[13]。3，4-二氯异香豆素能够通过上调BGC-823细胞中的Smad1水平发挥抗肿瘤的作用[14]。

表3 阻断Akt信号通路后细胞存活率

Note：1)P<0.01 vs matched group.

图4 Western blot检测阻断Akt信号通路后细胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表达结果Fig.4 Expression of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in gastric adenocarcinoma cells after Akt signaling pathway blocked by Western blotNote:1.Matched group；2.Control group.

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路广泛存在于生命机体中，在细胞生长、增殖等过程中发挥重要作用[15]。有研究表明，Akt信号通路在乳腺癌、肝癌、结直肠癌等多种癌症中异常活化，而磷酸化的Akt(p-Akt)具有促进癌细胞增殖的作用[16,17]。用不同浓度的Akt信号通路抑制剂LY294002处理舌鳞癌细胞后，舌鳞癌细胞增殖和迁移受到抑制[18]。基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质，在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶的重要成员，在癌症组织中过度表达[19]。

本研究中，用Western blot法检测了胃腺癌组织中Smad1的水平。结果发现，Smad1在胃腺癌组织中表达下调。进一步通过体外实验研究Smad1对胃腺癌细胞增殖迁移的影响。通过细胞转染分别过表达和抑制了胃腺癌细胞中Smad1的水平，结果发现，过表达Smad1的细胞存活率和细胞迁移能力均明显降低。这提示，Smad1在胃腺癌细胞生长过程中发挥抑癌基因的作用。过表达Smad1的胃腺癌细胞中MMP-2、MMP-9的表达也明显减弱，这说明Smad1可能是通过调控MMP-2和MMP-9影响胃腺癌细胞迁移能力的。结果还发现，过表达Smad1的细胞中p-Akt水平降低。本研究进一步用Akt信号通路抑制剂作用于胃腺癌细胞，细胞存活率和迁移率降低。这提示，Smad1能够抑制Akt信号通路的激活影响胃腺癌细胞的增殖和迁移。

综上所述，Smad1在胃腺癌组织中表达下调。Smad1能够抑制胃腺癌细胞的增殖和迁移发挥抑癌基因的作用，作用机制与Akt信号通路有关。本研究结果为进一步研究Smad1在胃腺癌发病机制中作用奠定了基础，为治疗胃腺癌提供了新方向。

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[收稿2016-10-19 修回2016-11-29]

(编辑 许四平)

StudyonexpressionofSmad1ingastricadenocarcinomaanditseffectonmigrationabilityofgastriccancercells

WANGXin,LIYi-Jiong,PANGChao,ZHANGRui-Hua,YANGYan-Hong,ZHUZhen-Long,WANGZheng-Min.DepartmentofPathology,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

Objective:To investigate the expression of Smad1 in gastric carcinoma and the influence on the migration ability of gastric cancer cells.Methods:Collected the protein from the gastric cancer tissues and corresponding adjacent tissues,the expression level of Smad1 was detected by Western blot.In HGC-27 gastric cancer cells as the research object,the carrier cells transfected with overexpression of Smad1 (p-EGFP-C1/Smad1) and Smad1 small interfering RNA (Smad1 siRNA),while transfection of p-EGFP-C1 and siRNA control as control.MTT to detect cell proliferation.Cell migration ability was detected with cell scratch test.The expression levels of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in cells were detected by Western blot.Akt signal pathway inhibitor LY294002 (20 μg/ml) in gastric adenocarcinoma cells,MTT for cell proliferation,cell scratch assay for cell migration.The expression levels of MMP-9,MMP-2,p-Akt,Akt were detected by Western blot.Results:Smad1 in gastric carcinoma was significantly lower than the adjacent tissues (P<0.01).The cell survival rate and migration rate of p-EGFP-C1/Smad1 group were significantly lower than that of p-EGFP-C1 group (P<0.01).The cell survival rate and migration rate of Smad1 siRNA group were significantly higher than those in the siRNA control group (P<0.01).The expression levels of Akt protein in P-EGFP-C1,p-EGFP-C1/Smad1,Smad1 siRNA,siRNA control cells did not change.The expression levels of MMP-9,MMP-2 and p-Akt in p-EGFP-C1/Smad1 group were significantly lower than that in p-EGFP-C1 group (P<0.01).The expression levels of MMP-9,MMP-2 and p-Akt in Smad1 siRNA group were significantly higher than that in control siRNA (P<0.01).The cell proliferation and migration trends in gastric cancer cells effected by Akt signaling pathway inhibitor consistent with the p-EGFP-C1/Smad1 group.Conclusion:Low expression of Smad1 in gastric cancer tissue.Smad1 can inhibit the proliferation and migration of gastric cancer cells,the mechanism of action is related to the Akt signaling pathway.

Gastric adenocarcinoma;Akt signal pathway;Proliferation;Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.008

①本文为河北省卫计委青年科技课题(20150642)项目。

②通讯作者，河北医科大学第一医院骨科，石家庄 050031，E-mail:185985103@qq.com。

王 欣(1982年-)，女，硕士，主治医师，主要从事临床肿瘤病理的研究，E-mail:wangxin1850@163.com。

R735.2

A

1000-484X(2017)06-0844-05