抗人PD-L1单克隆抗体的制备及其应用①

冯沛然 黄建芳 王敏珍 廖伟聪 郝代玲 向军俭

(暨南大学抗体工程研究中心，广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州510632)

抗人PD-L1单克隆抗体的制备及其应用①

冯沛然 黄建芳 王敏珍②廖伟聪 郝代玲 向军俭

(暨南大学抗体工程研究中心，广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州510632)

目的：获得能应用于临床诊断以及阻断PD-L1与PD-1结合的抗人PD-L1单克隆抗体。方法：采用重组表达的人PD-L1蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合技术获得稳定分泌抗人PD-L1单抗的阳性细胞株，ELISA方法鉴定抗体的特异性、亲和力、亚型等方面特性；免疫印迹、间接免疫荧光方法对肿瘤细胞进行检测；肿瘤杀伤实验验证抗体阻断活性。结果：共获得2株抗人PD-L1单抗，抗体效价分别为1∶2.56×106和1∶3×105，亲和力分别为1.5×109L/mol和2.5×108L/mol，均与PD-L2蛋白无交叉反应。免疫印迹、间接免疫荧光证实抗体有诊断作用。杀伤实验显示抗体有阻断作用。结论：共获得两株稳定分泌高效价、高特异性的抗人PD-L1单抗的杂交瘤细胞株，能作为诊断抗体应用于肿瘤表型检测和预后有效性的评估。抗体的阻断功能可应用于联合CIK细胞免疫治疗。

PD-L1；单克隆抗体；流式细胞术；CIK细胞；肿瘤诊断

程序性细胞死亡配体(Programmed cell death ligand-1，PD-L1)也称B7-H1、CD274，主要表达于活化的T细胞、B 细胞、巨噬细胞、树突状细胞表面。PD-L1与表达于活化T细胞表面的PD-1结合后可向T细胞传递抑制信号，抑制T细胞的功能。在肿瘤抗机体免疫中，肿瘤组织异常高表达PD-L1，通过与PD-1结合抑制CTL对其的杀伤，PD-1/PD-L1通路与免疫细胞的抗肿瘤免疫应答息息相关。Francisco等[1]发现Treg细胞表面高表达PD-1分子，其通过PD-1/PD-L1执行其免疫调节作用。当PD-1与APC细胞上的PD-L1结合后可抑制CD8+T细胞的活化，促进CD4+T细胞的活化，从而对免疫系统进行负调节。Dong等[2]制备出抗人B7-H1的单克隆抗体，通过流式免疫荧光标记方法检测B7-H1主要高表达于肿瘤细胞而非正常组织，并通过体内和体外实验均发现肿瘤相关的B7-H1的表达能增加CTL细胞的凋亡，而阻断PD-1/PD-L1通路恢复CTL对肿瘤细胞的杀伤能力。Castella等[3]在多发性骨髓瘤患者(MM)骨髓中的Vγ9Vδ2-T细胞中发现其PD-1异常高表达，首次报道PD-1在肿瘤区域中Vγ9Vδ2-T细胞中的表达，并发现MM患者BM中Vγ9Vδ2-T细胞经过PD-1治疗后增长率提高了2倍，细胞毒性提高了5倍。Khan等[4]还发现高表达PD-L1的B细胞能抑制B细胞的体液免疫功能。早在2002年已经报道了PD-L1能协助肿瘤进行免疫逃逸，接下来的报道逐渐证明阻断PD-1/PD-L1通路能增强T细胞的抗肿瘤免疫应答能力[5-7]。临床的研究表明PD-L1的表达与疾病进行以及预后效果息息相关。因此，运用抗PD-1或抗PD-L1的单克隆抗体将PD-1/PD-L1信号通路阻断成为一种新的免疫治疗手段[8]。免疫检查点抑制疗法在临床上如火如荼地进行着，最热门的PD-1/PD-L1抗体免疫治疗占据免疫检查点治疗20%的比例。2016年5月18日，罗氏PD-L1药物Atezolizumab获得FDA批准，用于膀胱癌适用症，成为第一个上市的PD-L1药物；2017年3月23日，FDA批准默克/辉瑞旗下的Avelumab上市，成为第二个上市的PD-L1药物。目前还在临床试验的还有BMS-936559、MEDI4736、MPDL3280A等抗体，PD-L1抗体药物的发展前景十分广阔。

本研究旨在通过杂交瘤细胞融合技术筛选出能分泌高特异性、高亲和力的抗人PD-L1单克隆抗体细胞株，结合流式细胞术验证抗体与肿瘤细胞表面的结合能力，用肿瘤杀伤实验验证抗体的阻断功能，为后续检测抗体以及抗体药物的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 人PD-L1重组蛋白(novop-rotein,Catalog# C315)；抗人PD-L1标准抗体(R&D,Catalog# MAB1561)；Freund完全佐剂、Freund不完全佐剂、BCA protein assay kit购自Pierce公司，PRMI1640 培养基、胎牛血清、HAT、HT均为Gibco公司产品;SBA Clonotyping System-HRP(Southern-Biotech,5300-05);质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自Magen公司；APC-PD-L1、Alexa Flour 647 Goat anti-mouse IgG购自Biolegend;CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒(Promega,Catalog# G1780);酶标二抗(KPL,Catalog #074-1806)。

1.1.2实验材料 无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级BALB/c纯系雌性小鼠，鼠龄6～8周，购自南方医科大学动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞、Caov3、H1299、OV2008、C13、A549、A549/DDP、MCF-7等肿瘤细胞株为暨南大学抗体工程中心实验室传代保存；正常人血清采集于健康志愿者。

1.2实验方法

1.2.1PD-L1 mAb的制备 采用购买的人PD-L1重组蛋白为免疫原，取6周龄的BALB/c雌鼠，皮下多点免疫方法，免疫剂量为50 μg/只。采用常规细胞融合及筛选方法[9],最终筛选出4株阳性细胞株，采用小鼠体内诱生法制备腹水型抗体；Protein G亲和层析柱进行纯化后备用。

1.2.2PD-L1 mAb Ig类及亚类的鉴定 采用SBA Clonotyping System-HRP试剂盒对筛选的抗体Ig类及亚类进行测定，所有操作严格依照试剂盒说明书操作。

1.2.3PD-L1 mAb抗体亲和常数的测定 非竞争酶免疫实验测定其亲和常数(Affinity constant)，Ka值。参考Raghava等[10]的方法，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数Ka值。

1.2.4PD-L1 mAb抗体特异性的鉴定 将人PD-L2蛋白稀释为1 μg/ml，每孔100 μl加入酶标板中，4℃孵育过夜。用含0.05%吐温的PBST洗涤3次，每次3 min，再用5%的脱脂奶粉于37℃封闭1 h,PBST洗涤3次，每次3 min。将纯化后抗体从1∶1 000开始进行倍比稀释。每孔加入100 μl,37℃孵育1 h。PBST洗涤3 次，每次3 min,再加入8 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠酶标二抗100 μl，37℃孵育40 min。PBST 洗涤5次，加入TMB单组分显色液，室温避光反应10 min后加入50 μl浓硫酸终止液终止反应，酶标仪读取OD450值，进行结果分析。

1.2.5PD-L1抗体在Western blot检测上的应用 裂解肿瘤细胞，提取总蛋白[11]，经SDS-PAGE电泳后将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭膜后加入稀释的PD-L1纯化抗体(1∶2 000)，4℃反应过夜后取出膜PBST洗涤3次，加入HRP酶标二抗(1∶8 000)室温反应1 h，洗涤5次，加入化学发光液反应，在凝胶成像仪成像。

1.2.6PD-L1抗体在流式检测肿瘤细胞PD-L1表型上的应用 离心收集细胞，用PBS洗涤，用制备的抗体(10 μg/ml)与肿瘤细胞室温孵育15 min,预冷PBS洗涤1次后加入Alexa Flour 647 Goat anti-mouse IgG室温避光反应15 min，预冷PBS洗涤1次后用300 μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测[12]。

1.2.7PD-L1单抗阻断功能验证 CIK(Cytokine-induced killer)是体外培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群[13]，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。然而，CIK在肿瘤杀伤过程中，受到PD-1/PD-L1信号的限制，在高表达PD-L1的肿瘤杀伤中效果不佳，因此，阻断PD-1/PD-L1通路是增强CIK免疫治疗的有力措施。

从外周血中分离PBMC细胞，第0天加入1 000 U/ml IFN-γ 37℃,5%CO2培养；24 h后加入50 ng/ml 的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖[14]；每3 d半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；在培养的第14天，收获CIK细胞。用anti-TCR抗体刺激CIK细胞，每隔6 h收集细胞检测其PD-1表达情况。另外，用CIK细胞与肿瘤细胞A549/DDP以40∶1、20∶1、10∶1、5∶1比例混合，并加入PD-L1抗体10 μg/ml，37℃ 5%CO2培养4～6 h，用CytoTox96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒检测各组释放LDH的量，通过公式：%Cytotoxicity=(LDHexperimental-LDHeffector cells-LDHspontaneous)/(LDHmaximal-LDHspontaneous)×100%，计算CIK细胞的肿瘤杀伤率[15]。

1.3统计学分析 采用Graph Pad Prism 5.0软件进行作图，并分析不同数据间统计学差异。运用SPSS软件对不同组数据之间进行统计学分析。

2 结果

2.1抗人PD-L1蛋白单克隆抗体的制备 用购买的重组人PD-L1蛋白免疫BALB/c小鼠3次，按常规方法进行细胞融合，通过3次阳性克隆，获得4株稳定分泌抗人PD-L1单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为Ab1、Ab2、Ab3、Ab4。制备大量的腹水型抗体后，通过亲和纯化，用还原性SDS-PAGE分析。结果显示，抗体重链和轻链条带Mr分别在50 bp和25 bp 左右(图1)，无明显杂带，抗体纯化效果较好，可用于后续实验。

2.2抗人PD-L1抗体Ig 亚型、腹水效价及特异性鉴定 用SBA小鼠mAb分型试剂盒测定纯化的4种单克隆抗体Ig类及其亚类。结果显示Ab3为IgG2b，其余3株抗体均为IgG1。采用间接ELISA对4株抗体效价进行测定，结果显示其腹水效价在1∶2.56×106～1∶4×104之间，亲和力在1.5×109～1.0×107之间，且与结构及功能相似的PD-L2蛋白无明显交叉反应，说明特异性较好(表1)。

2.3PD-L1抗体在Western blot检测肿瘤细胞PD-L1蛋白表达量上的应用 用Ab2抗体对肿瘤细胞裂解液中PD-L1蛋白进行反应，结果见图2。结果显示Ab2抗体能在蛋白水平上与肿瘤细胞中PD-L1蛋白结合， 无明显杂带，说明抗体特异性良好，能应用于Western blot方法检测肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达量。

表1 抗体特异鉴定

Note：“-”Indicating that the OD450 value is less than twice the negative value,proved no cross-reaction with the PD-L2 protein.

图2 PD-L1单抗应用于免疫印迹分析不同肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达Fig.2 Expression of PD-L1 in different kinds of tumor cell lines were analyzed by Western blot used PD-L1 mAb

图3 流式细胞术分析不同肿瘤细胞系中PD-L1蛋白的表达Fig.3 Expression of PD-L1 in different kinds of tumor cell lines were analyzed by FACS

图4 PD-L1抗体在CIK细胞杀伤肿瘤中的作用Fig.4 Function of PD-L1 antibody in CIK cell killing tumorNote:A.Differential expression of two main phenotypic subsets of CIK cells over in vitro culture are shown for identification of CIK cells,CD3/CD56/CD8;B.PD-1 expression after CIK cell activation;C.PD-L1 blocking antibodies efficiently increases tumor-killing activity of CIK cells.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.4PD-L1抗体在流式检测肿瘤细胞PD-L1表型上的应用 用制备的Ab1作为一抗，Alexa Flour 647 Goat anti-mouse IgG作为荧光二抗，采用流式细胞仪检测肿瘤细胞膜表面PD-L1蛋白表达情况，结果见图3。结果显示制备的Ab1抗体能特异性标记肿瘤细胞膜PD-L1蛋白，说明Ab1能与PD-L1天然蛋白特异性结合，能很好的应用于流式检测抗体。

2.5抗体具有促进CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用 因CIK有CTL(杀伤性T细胞)的特性，因此具有CD3+CD8+表型；另一方面它还具有NK细胞的非MHC限制性杀伤特性，因此具有CD56+表型。培养14 d后的CIK细胞中CD3+CD8+细胞比例高达77.7%，CD3+CD56+细胞比例高达43.3%(见图4A)，证明CIK细胞培养成功，可用于后续实验。

用anti-TCR抗体激活CIK细胞后发现其PD-1分子表达量显著增高(见图4B)，证明PD-1分子在CIK细胞激活后表达升高，从而通过PD-1/PD-L1通路负调控CIK细胞的活性和功能。用培养14 d的成熟CIK细胞对肿瘤细胞系A549/DDP进行杀伤，并加入PD-L1抗体和Control IgG，检测靶细胞的死亡率。结果显示与对照组相比，加入Ab1和Ab2抗体组均能促进CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤(见图4C)，表明这两株抗体可能具有阻断PD-1/PD-L1通路活性，进而在细胞免疫治疗中发挥促进肿瘤杀伤的作用。

3 讨论

近来越来越多的研究表明，PD-1以及PD-L1的表达与癌症患者的临床病征以及预后密切相关[16]，因此PD-L1抗体无论在检测诊断中或者药物治疗中都有着广阔的应用前景。本研究通过免疫PD-L1重组蛋白，经过细胞融合、克隆化筛选、抗体大量制备、纯化等技术获得了4株特异性识别人PD-L1蛋白的单克隆细胞株，其中Ab1和Ab2具有较高的滴度和亲和力，Ab1腹水型抗体效价更是高达1∶2.56×106，明显优于国内报道制备的抗人PD-L1单抗[17]；在流式检测中，Ab1抗体的工作浓度为3 μg/106cells，略低于国外生产的流式检测抗体(2.5 μg/106cells)；后续实验将改进检测方法以提高检测灵敏度。所获得的Ab2抗体在Western blot 检测肿瘤细胞表面PD-L1表达量中抗体工作浓度为 2 μg/ml，检测条带单一清晰，说明其特异性强，可适用于Western blot检测；制备的Ab1、Ab2抗体能促进CIK细胞对A549/DDP细胞系的杀伤作用，证实该抗体具有一定的阻断PD-1/PD-L1通路的作用，可作为阻断抗体应用于临床研究。

随着PD-1/PD-L1抗体治疗的广泛应用，PD-L1在肿瘤及正常组织上的检测成为评估该治疗方法有效性的重要指标。而国外的检测抗体价格普遍偏高，因此制备成本较低的高效价、高特异性PD-L1抗体具有极大的意义，而本研究制备的抗体能满足基本的检测需要。但是由于制备的PD-L1抗体是鼠源抗体，在肿瘤治疗中将有很大的限制，后续研究将进行人源化改造以及亲和力成熟，为进一步PD-L1抗体药物的研发奠定基础。

[1] Francisco LM,Sage PT,Sharpe AH.The PD-1 pathway in tolerance and autoimmunity[J].Immunol Rev,2010,236(1):219-242.

[2] Dong H,Strome SE,Salomao DR,etal.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med,2002,8(8):793-800.

[3] Castella B,Foglietta M,Sciancalepore P,etal.Anergic bone marrow Vγ9Vδ2 T cells as early and long-lasting markers of PD-1-targetable microenvironment-induced immune suppression in human myeloma[J].Oncoimmunology,2015,4(11):e1047580.

[4] Khan AR,Hams E,Floudas A,etal.PD-L1hi B cells are critical regulators of humoral immunity[J].Nat Commun,2015,6:5997.

[5] Hamanishi J,Mandai M,Iwasaki M,etal.Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer[J].Proc Natl Acad Sci,2007,104(9):3360-3365.

[6] Thompson RH,Kuntz SM,Leibovich BC,etal.Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up[J].Cancer Res,2006,66(7):3381-3385.

[7] Thompson RH,Gillett MD,Cheville JC,etal.Costimulatory molecule B7-H1 in primary and metastatic clear cell renal cell carcinoma[J].Cancer,2005,104(10):2084-2091.

[8] Ohaegbulam KC,Assal A,Lazar-Molnar E,etal.Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway[J].Trends Mol Med,2015,21(1):24-33.

[9] 刘诗琴,黄建芳,向军俭,等.人 N 端脑钠肽前体 (NT-ProBNP) 单抗制备及双抗体夹心 ELISA 检测方法的建立[J].免疫学杂志,2016,32(5):441-445.

[10] Raghava GPS,Agrewala JN.Method for determining the affinity of monoclonal antibody using non-competitive ELISA:a computer program[J].J Immunoassay Immunochem,1994,15(2):115-128.

[11] 周 莹,陈永井,张学光,等.鼠抗人 PD-L1 功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(11):1208-1211.

[12] Sun J,Xu K,Wu C,etal.PD-L1 expression analysis in gastric carcinoma tissue and blocking of tumor‐associated PD-L1 signaling by two functional monoclonal antibodies[J].Tissue Antigens,2007,69(1):19-27.

[13] Jiang J,Wu C,Lu B.Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J].J Transl Med,2013,11(1):83.

[14] Dai C,Lin F,Geng R,etal.Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer[J].Oncotarget,2016,7(9):10332.

[15] Zhu B,Ju S,Shu Y.CD137 enhances cytotoxicity of CD3+CD56+cells and their capacities to induce CD4+Th1 responses[J].Biomed Pharmacother,2009,63(7):509-516.

[16] 唐宛豫,张国伟,王慧娟,等.PD-1/PD-L1 抑制剂在晚期非小细胞肺癌中的临床进展与治疗策略[J].中国免疫学杂志,2016,32(10):1558-1561.

[17] 陈 娇,戴丽娜,张 平,等.鼠抗人 PD-L1 单克隆抗体的制备及鉴定[J].四川大学学报:医学版,2011,42(1):5-9.

[收稿2017-03-13 修回2017-04-09]

(编辑 倪 鹏)

Preparationandapplicationofanti-humanPD-L1monoclonalantibodies

FENGPei-Ran,HUANGJian-Fang,WANGMin-Zhen,LIAOWei-Cong,HAODai-Ling,XIANGJun-Jian.AntibodyEngineeringResearchCenter,JinanUniversity,GuangdongProvinceKeyLaboratoryofMolecularImmunologyandAntibodyEngineering,Guangzhou510632,China

Objective:To obtain a high specificity and high affinity anti-human PD-L1 monoclonal antibody which can be used for clinical diagnosis and block PD-L1 and PD-1 binding.Methods:BALB/c mice were immunized with recombinant PD-L1 protein.The positive cell clones stably secreting anti-human PD-L1 monoclonal antibody were obtained by classical hybridoma cell fusion technique.The specificity,affinity,subtype and other characteristics of the antibody were identified by ELISA.Immunofluorescence and indirect immunofluorescence were used to detect the tumor cells.Antibody blocking activity was confirmed by tumor killing test.Results:Two cell strains stably secreting monoclonal antibodies against human PD-L1 were screened out.Ab1 and Ab2 had high titer and affinity.The antibody titers were 1∶2.56×106and 1∶3×105,and the affinity was 1.5×109L/mol and 2.5×108L/mol respectively.There was no cross reaction between these two antibodies and PD-L2.Immunoblotting,indirect immunofluorescence confirmed that the antibody can be used to the diagnosis.Experiment showed that PD-L1 antibodies can increases tumor-killing activity of CIK cells.Conclusion:Two hybridoma cell lines capable of stably secreting highly specific and high affinity anti-human PD-L1 monoclonal antibody are obtained.They can specifically bind to PD-L1 molecules on tumor cells and can be used to the diagnosis of tumor phenotype and prognosis.Antibody blocking function can be applied to combined CIK cell immunotherapy.

PD-L1；Monoclonal antibody；Flow cytometry；Cytokine-induced killer cells；Tumor diagnosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.015

①本文为广东省人才引进创新团队项目《重大疾病的临床诊断试剂研发》(2013S028)。

②暨南大学转化医学转化研究院国际免疫学中心，广州510632。

冯沛然(1992年-)，女，在读硕士，主要从事抗体制备及应用方面研究。

及指导教师：向军俭(1952年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事工程抗体及其应用研究，E-mail:txjj@jnu.edu.cn。

R392.1

A

1000-484X(2017)06-0879-05