男性年龄与精子顶体酶活性及精子DNA碎片指数的相关性分析

李雪瑶，杨菁，李洁，徐玲

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060)

男性年龄与精子顶体酶活性及精子DNA碎片指数的相关性分析

李雪瑶，杨菁*，李洁，徐玲

(武汉大学人民医院生殖医学中心，武汉 430060)

目的探讨男性年龄与精子顶体酶活性、精子DNA碎片指数(DFI)的相关性。方法选取2016年1～8月在我院生殖医学中心就诊的436例不育症男性患者为研究对象，所有患者均行精液常规检查、精子顶体酶活性检查和(或)精子DFI分析。将患者按年龄分为<30岁、30～39岁、≥40岁3组，分析各组的精液常规、顶体酶活性及精子核DFI的差异及其相关性。结果不同年龄段患者的体重指数(BMI)、禁欲天数、精液量无显著性差异(P>0.05)；年龄≥40岁组患者的前向运动精子百分率、活动精子百分率及精子顶体酶活性显著低于<30岁和30～39岁组(P<0.05)；≥40岁组患者的精子DFI显著高于<30岁和30～39岁组(P<0.05)。年龄与前向运动精子百分率及活动精子百分率之间呈负相关(P<0.05)，但是相关性较弱。精子顶体酶活性与精子正常形态率、前向运动精子百分率、非前向运动精子百分率、活动精子百分率呈正相关(P<0.05)；精子DFI与年龄、禁欲天数、前向运动精子百分率呈正相关(P<0.01)，与精液量、精子浓度、活动精子百分率呈负相关(P<0.05)；精子顶体酶活性和DFI之间无相关性(P>0.05)。结论年龄增长会导致精液前向运动精子百分率、活动精子百分率、精子顶体酶活性、DFI等参数改变，直接或间接影响男性生育力。说明年龄对男性不育的影响是多方面的，建议有生育需求的大龄(≥40岁)男性尽早进行生育咨询与评估。

男性； 年龄； 顶体酶活性； 精子DNA碎片指数； 精液常规

(JReprodMed2017，26(9)：869-873)

不孕不育不仅影响患者身心健康，而且严重影响家庭和谐，逐渐成为一个全球性的问题。与此同时，晚婚晚育、二胎政策的开放以及失独等社会因素，使得大量高龄夫妻有了迫切的生育要求。但是，越来越多的证据表明，随着年龄增大，女性的生育力明显下降，且男性生育力也有所下降[1-3]。一般认为，女性年龄超过35岁，其生育力、正常受精率、妊娠率及活产率等明显下降，而年龄对于男性生育力的影响以及影响程度，目前尚无定论。大数据的回顾性分析发现，在调整了其他因素的影响后，女性年龄≥35岁，流产风险明显升高；而当女性年龄≥35岁，且男性年龄≥40岁时，其流产的风险值更高[4-5]。有研究表明，男性年龄的增大会导致男性性功能下降，以及精液质量如精子正常形态率与精子活力的下降[6-7]。精子顶体酶是一种以酶原形式贮存在精子顶体内的胰蛋白酶，受精时，精子顶体酶释放，为精卵结合创造条件[8]，因此着床率的下降可能与顶体酶活性的降低、精卵结合困难有关。也有学者发现，男性年龄的增大使精子基因组的缺陷发生率增大[9]，比如与患病率显著增加相关的基因组与精子外遗传性缺陷，也可能与精子DNA碎片指数(DFI)增大[10]、氧化应激损害等有关。还有研究表明，在自然妊娠与人工授精过程中，去掉女性年龄因素的影响后发现，随着其配偶的年龄增大，女性妊娠率降低，而自然流产率增高[11-12]。

本研究拟通过分析、比较不同年龄段的男性(<30岁、30～39岁、≥40岁)精液常规参数、精子顶体酶活性及精子DFI的关系，探讨年龄对男性不育的影响。

材料与方法

一、研究对象

收集2016年1～8月在我院生殖医学中心就诊的不育症男性患者资料。纳入标准：(1)身体状况良好；(2)体格检查男性生殖器无发育畸形；(3)抽血排除肝肾功能异常等；(4)进行了精液常规检查、精子顶体酶活性检查和(或)精子DFI分析。排除标准：(1)精液不液化；(2)手淫取精失败或精液洒出等。所有患者签署知情同意书，一共纳入436例患者，全部进行了精液常规的检查，其中277例患者进行了精子顶体酶活性的检查，415例患者进行了精子DFI检查，257例患者同时进行了精子顶体酶活性与精子DFI检查。

二、研究方法

1.分组：根据年龄不同将患者分为3组：<30岁组(96例)、30～39岁组(253例)、≥40岁组(87例)。

2.精液标本采集及处理：建议患者禁欲3～7 d，手淫取精法获取精液，并将全部精液装于一次性尿杯，37℃水浴箱内液化30 min。排除液化时间大于60 min的标本。

3.精液常规检查：参照第五版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》[13]推荐的方法检测，包括精液体积、液化时间、pH值、精子浓度、正常形态率、精子活力。精液分析仪为西班牙CSA全自动精子质量分析系统。

4.精子顶体酶活性检测：使用精子顶体染色试剂盒(PSA-FITC，深圳华康生物)检测精子顶体酶活性，简要步骤如下：测定精液常规参数后，测定和对照Ep管中加入7.5×106个精子，离心去除精浆，按照试剂盒使用说明操作，依次加入相关试剂，水浴后离心，紫外分光光度计读取各管405 nm的OD值，计算顶体酶活性。精子顶体酶活性正常参考值为48.2～218.7 μIU/106精子。共检查277例，<30岁组64例，30～39岁组157例，≥40岁组56例。

5.精子DFI检查：采用精子核染色体结构检测(SCSA法)，使用精子核碎片检试剂盒(杭州星博生物科技)，调整精子密度为1×106～2×106个/ml，取100 μl检测精子染色质结构完整性。严格按照试剂盒说明书操作步骤，使用流式细胞仪(Accuri C6，BD，美国)进行定量分析，通过软件计算精子DFI。DFI正常参考值<15%，15～30%为偏高，≥30%认为碎片指数异常，考虑精子核DNA完整性差。共检查415例，<30岁组90例，30～39岁组240例，≥40岁组85例。

三、统计学分析

结 果

一、各组患者一般资料及精液常规参数比较

各组患者的体重指数(BMI)均在正常范围内，组间比较无显著性差异(P>0.05)。精液常规参数比较发现：<30岁与30～39岁组的精子浓度略高于≥40岁组，但无显著性差异(P>0.05)；前向运动精子百分率及活动精子百分率显著高于≥40岁组(P<0.05)。30～39岁组的精子正常形态率显著高于≥40岁组(P<0.05)。3组患者禁欲天数、精液量及非前向运动精子百分率比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 三组患者的一般资料与精液常规参数比较(-±s)

注：与≥40岁组比较，*P<0.05，**P<0.01

二、患者年龄与BMI、精液常规参数的相关性

统计结果显示：年龄与BMI、禁欲天数、精液量、浓度、正常形态率、非前向运动精子百分率之间无相关性，与前向运动精子百分率及活动精子百分率之间呈负相关(P<0.05)，但是相关性较弱(r分别为-0.079和-0.142)(表2)。

表2 患者年龄与BMI、精液常规参数的相关性

三、三组患者精子顶体酶活性与DFI的比较

统计结果表明：与≥40岁组相比，<30岁与30～39岁组的精子顶体酶活性显著升高(表3a)，而DFI显著下降(P均<0.05)(表3b)

表3a 不同年龄段男性精子顶体酶活性比较(-±s)

注：与≥40岁组比较，*P<0.05

表3b 不同年龄段男性精子DFI比较(-±s)

注：与≥40岁组比较，**P<0.01

四、顶体酶活性及DFI与年龄及精液常规参数的相关性

相关性分析结果显示：精子顶体酶活性与精子正常形态率、前向运动精子百分率、非前向运动精子百分率、活动精子百分率呈正相关(P<0.05)；精子的DFI与年龄、禁欲天数、前向运动精子百分率呈正相关(P<0.01)，与精液量、精子浓度、活动精子百分率呈负相关(P<0.05)；精子顶体酶活性和DFI之间无相关性(表4)。

讨 论

本文通过分析<30岁、30～39岁、≥40岁3个不同年龄段男性的精液常规检查、精子顶体酶活性与精子DFI结果的相关性，探讨年龄对男性不育的影响，结果显示随着年龄的增长，男性的BMI、禁欲天数、精液体积无明显变化，精子浓度呈下降趋势，特别是≥40岁的男性，但是差异无统计学意义。<30岁与30～39岁男性之间的精液参数、顶体酶活性与DFI无明显差异，而≥40岁男性的精子正常形态率与前向运动精子百分率、活动精子百分率、顶体酶活性较<30岁与30～39岁男性相比明显下降，DFI呈显著上升趋势(P均<0.05)，说明男性年龄对男性不育有多方面的影响，其进一步的关系需要更大样本量的研究。

有研究表明，男性年龄的增大导致的不育与精液体积、精子数量的减少、精子活力的下降，以及正常形态精子的减少密切相关[14-15]，这与本研究结果一致。供卵试管婴儿中，消除了女性年龄的影响后发现，男方年龄超过50岁后，囊胚形成率与妊娠结局受到明显影响，而且随着年龄的增大，精液体积与精子活性有下降趋势[16]。精子顶体酶下降会导致卵丘分解及透明带的穿透失败，从而影响男性生育力[10]。精子核DNA 关系到父系遗传，DNA的完整性是保持物种完整性、成功受精和胚胎发育的基础。Aitken等[17]研究发现，随着男性年龄的增加，精子DFI也随之升高，二者呈明显正相关，与本研究一致。多项研究表明，DFI能够较准确地评价男性生育力，精子DNA损伤可以导致受精失败或影响受精后原核的形成、胚胎着床、胚胎发育和子代的健康[18-19]。年龄的增大导致核苷酸的多态性，有研究显示，随着父方年龄的增大，单基因新创突变会每年增加两个[20]，这可能对子代造成极大的影响。还有研究证实，年龄>35岁的男性，其总睾酮与游离睾酮显著低于年龄≤35岁的男性，而LH与FSH无明显差异[21]，说明年龄越大的男性，其睾丸对LH与FSH的反应性越差，从而间接影响男性生育力。而年龄的增大，可由于氧化应激[22]、内分泌问题[10]、辐射等多种原因，导致男性不育。有学者认为，年龄增长导致男性睾丸、附睾等生殖系统器官发生退化，性功能减退导致不育[23]。也有人认为，由于年龄的增大，罹患各种疾病的概率因此增大，间接影响男性生育力[24]。

进行相关性分析发现，精子正常形态率、前向运动精子百分率、非前向运动精子百分率以及活动精子百分率与精子顶体酶活性正相关(P<0.05)，说明精子顶体酶活性能够较好地反映精液质量，提示其可以作为评估男性生育力的指标之一，这与之前一些文献[25-29]的观点一致。有学者认为，精子畸形可能导致顶体缺失、过薄、顶体不完整等情况[30-32]，可能影响卵细胞卵丘的分解及精子对卵母细胞透明带的穿透[8]，从而导致男性不育。DFI与年龄、禁欲天数呈正相关，这与刘安娜[33]的研究一致，可能因为年龄与禁欲天数的增加，导致氧化应激等的累积增多，精子DNA的损伤加重，因此DFI增加。Evenson等[34]认为DFI 10%～15%为高生育力，16%～29%为中度生育力，≥30%为低度生育力，≥80%为无生育能力。本研究中，<30岁男性平均DFI为24.33%，30～39岁男性25.10%，≥40岁男性高达37.80%，3组患者DFI平均值均较高，可能因为本研究纳入的人群较多倾向于不育患者。

综上所述，男性不育的影响因素有多种，且机制错综复杂，年龄只是其中一个直接或间接的因素，但是年龄对于男性不育的影响是多方面的。虽然相对于女性，男性年龄对于妊娠结局的影响较小，但是年龄对于男性不育的影响仍是不可忽视的，所以对有生育需求的年龄较大的男性，特别是超过40岁的男性，建议尽早进行相关检查，进行生育咨询与评估。

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[编辑：辛玲]

Relationshipbetweenspermacrosinactivity&spermDNAfragmentationindexandmaleage

LI Xue-yao，YANG Jing*，LI Jie，XU Ling

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

Objective： To analyze the relationship between male age and sperm acrosin activity，sperm DNA fragmentation index (DFI).

Methods： A total of 436 infertile men in our reproductive medical center from January to August 2016 were investigated.All the patients were conducted the examination of semen parameters，sperm acrosin activity and (or) sperm DFI.The patients were divided into 3 groups according to male age：<30 years group，31-39 years group，and≥40 years group.Comparison and correlation analysis among their semen parameters，sperm acrosin activity and sperm DFI were conducted.

Results： There were no significant differences in BMI，days of abstinence，semen volume among the three groups (P>0.05).The percentage of morphologically normal sperm，progressive sperm rate and sperm motility，sperm acrosin activity in ≥40 years group were significantly lower (P<0.05)，but DFI was significantly higher than <30 years group and 31-39 years group (P<0.05).There was a negative correlation between age and progressive sperm rate and sperm motility (P<0.05).There were positive correlations between sperm acrosin activity and the percentage of morphologically normal sperm，progressive sperm rate and motility (P<0.05).Sperm DFI was positively correlated with age，abstinence days，progressive sperm rate (P<0.01)，while it was negatively correlated with semen volume，semen concentration & motility (P<0.05).No correlation was found between sperm acrosin activity and DFI.

Conclusions： Increase of male age can lead to the deterioration of progressive sperm rate，sperm motility，sperm acrosin activity and sperm DFI，and directly or indirectly affects male infertility.Preconception counseling and evaluation of fertility are recommended for elder men (≥40 years) with reproduction requirement.

Male； Age； Sperm acrosin activity； Sperm DNA fragmentation index； Semen parameters

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.004

2017-03-21；

2017-04-24

国家自然科学基金(81401255)

李雪瑶，女，湖北咸宁人，硕士研究生，生殖医学专业.(*

，Email：dryangqing@hotmail.com)