ZEB1及Nestin在高级别胶质瘤初治及配对复发标本中的表达及临床意义

林才厚， 陈建屏， 王春华， 郑水顺， 祁小龙， 石松生

恶性胶质瘤的复发被认为是恶性胶质瘤高死亡率和致残率的重要原因[1]。尽管胶质瘤的综合治疗手段不断提高，但大部分高级别胶质瘤的无进展生存期(progression free survival, PFS)均未超过7月，而几乎所有胶质瘤患者36月内都会有病情进展[2]。因此，研究恶性胶质瘤复发的机制及与PFS的关系成了胶质瘤研究领域的新热点。

胶质瘤上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及胶质瘤干细胞对治疗的耐受被认为是目前恶性胶质瘤复发的重要原因[3-4]。ZEB1是胶质瘤EMT进程的重要启动分子，Nestin则是目前公认的胶质瘤干细胞标记物[5]。既往的研究大多集中于ZEB1及Nestin在胶质瘤上的表达及与预后的关系[5-8],而对于胶质瘤复发前后ZEB1及Nestin表达变化的研究甚少，特别是高级别胶质瘤ZEB1或Nestin表达与PFS的关系更是鲜有报道。本研究采用免疫组织化学法和图像分析技术对39例高级别胶质瘤复发前后石蜡标本中的ZEB1及Nestin进行检测，探讨这2个指标与患者PFS的相关性，及其在胶质瘤复发中的临床意义。

1 对象与方法

1.1对象 收集2008年1月-2013年1月于笔者单位接受手术治疗及规范放化疗的高级别胶质瘤患者39例，男性19例，女性20例，年龄(50.08±9.38)岁(35～71岁)。纳入标准：(1)患者均为原发胶质瘤，且初次行胶质瘤全切术，术后行规范化放疗及替莫唑胺化疗，由同一医院定期随访，第2次手术仍在同一医院进行；(2)无其他恶性肿瘤、全身系统性疾病及免疫性疾病；(3)有完整规范的术后病理报告、影像学资料及随访报告；(4)KPS>70分。排除标准：(1)患者非正常死亡；(2)随访中断患者。取患者初次及第2次手术的石蜡标本进行研究。

另收集同期就诊的因颅脑外伤行脑减压术的患者10例，男性6例，女性4例，年龄(39.7±12.69)岁(25～72岁)。纳入标准：术前身体健康，无其他恶性肿瘤、全身系统性疾病及免疫性疾病，头颅CT检查排除脑肿瘤性病变。取正常脑组织石蜡标本作为对照。对所有纳入研究的患者进行为期60月的随访，以患者死亡作为终点事件。所有研究事项均与患者及家属签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1材料 ZEB1兔多克隆抗体(货号：HPA027524，美国Sigma公司)；Nestin兔单克隆抗体(货号：ab105389，英国Abcam公司)。

1.2.2免疫组织化学染色 操作严格按说明书进行。石蜡切片经烤片及脱蜡水化后，用枸橼酸盐缓冲液高压抗原修复，3%过氧化氢封闭内源性过氧化酶，正常羊血清封闭，洗净后孵育一抗，4 ℃过夜。加二抗室温孵育20 min，经DAB显色和苏木精复染后，脱水封片。

1.2.3免疫组织化学评分标准 由2名病理科医师采用双盲法阅片，ZEB1及Nestin阳性染色镜下呈棕黄色或棕褐色，在高倍镜(×400)下随机选择5个视野，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析处理软件计算ZEB1及Nestin阳性细胞的平均光密度，代表ZEB1及Nestin的表达水平，并根据平均光密度的中位数将患者分为高表达组和低表达组[9]。

1.3随访 通过查阅病历资料采集患者的临床基本信息，包括影像学资料，并制定随访表，主要采用电话和门诊随访2种方式。影像学中坏死、卫星灶、囊变及肿瘤大小的区分参照文献[10]，并由2位神经外科医师和2位神经影像学医师共同判断结果。PFS定义为：患者第一次规范治疗后至临床随访判断肿瘤再次进展或者影像学检测提示肿瘤复发。

2 结 果

2.1ZEB1及Nestin在高级别胶质瘤上复发前后的表达 ZEB1在正常脑组织和复发前后的恶性胶质瘤脑组织中均有不同程度表达，主要表达于细胞膜和细胞核上(图1)。胶质瘤脑组织的ZEB1表达，复发前比正常脑组织明显增高[(0.609±0.133)vs(0.426±0.026 1),P<0.01]，复发后也较复发前明显增高[(0.703±0.176)vs(0.609±0.133),P<0.01]。Nestin在复发前后的恶性胶质瘤脑组织中呈不同程度表达，主要表达于细胞质中(图1)。胶质瘤脑组织的Nestin表达，复发后较复发前明显增高[(0.375±0.096 6)vs(0.333±0.071 0)，P=0.014]。

A～C：ZEB1在正常脑组织和同一例高级别胶质瘤患者复发前后的表达，复发后ZEB1表达明显高于复发前和正常脑组织；D～E：Nestin在同一例高级别胶质瘤患者复发前后的表达，复发后表达明显高于复发前.图1 ZEB1和Nestin在高级别胶质瘤中的表达(H-E染色 ×400)Fig 1 Expression of ZEB1 and Nestin in high grade gliomas(H-E staining ×400)

2.2高级别胶质瘤复发前ZEB1及Nestin表达与PFS的关系 根据复发前ZEB1及Nestin表达的平均光密度的中位数(0.643及0.337)将高级别胶质瘤分为高表达组和低表达组。单因素分析显示，ZEB1与Nestin与高级别胶质瘤的PFS有关(图2，表1)。Spearman法分析显示，随着Nestin表达增高，ZEB1表达明显增高。相关性分析显示，高级别胶质瘤复发前ZEB1的表达与Nestin的表达存在显著正相关(rs=0.670,P<0.001)。

PFS：无进展生存期. A：ZEB1低表达组较高表达组PFS长，经Log-rank检验，P<0.001； B：Nestin低表达组较高表达组PFS长，经Log-rank检验，P=0.004； C：Spearman法分析显示，ZEB1表达与Nestin表达呈正相关(rs=0.670,P<0.001).图2 ZEB1及Nestin表达与PFS的关系及ZEB1表达与Nestin表达的相关性Fig 2 The relationship of ZEB1, Nestin expression with PFS, and the correlation between ZEB1 expression and Nestin expression

表1 影响高级别胶质瘤PFS的临床指标的单因素分析

PFS：无进展生存期.

2.3高级别胶质瘤患者PFS影响因素的单因素和多因素分析 单因素分析显示，年龄(50岁为界)、卫星灶、坏死、ZEB1表达及Nestin表达与规范化治疗后高级别胶质瘤的PFS有相关性(表1)，而性别、病理分级、囊变及肿瘤大小(4 cm为界)与高级别胶质瘤的PFS无明显相关。使用Cox比例风险模型，采用逐步回归分析法，将单因素分析有意义的5种因素，包括年龄、卫星灶、坏死、ZEB1表达及Nestin表达进行多因素分析，结果显示，ZEB1表达为影响肿瘤PFS的独立因素(95%CI：3.016～19.194，P<0.001)。

3 讨 论

体外研究表明，高级别胶质瘤中因胶质瘤干细胞对治疗的抵抗导致其复发是其预后差的根本原因[11]，而有关体内胶质瘤复发与初治标本中胶质瘤干细胞表达差别的研究甚少。Nestin是经典的胶质瘤干细胞标记物[12]。本研究中，相较于初治标本，复发标本的Nestin较高，这意味着复发高级别胶质瘤中，胶质瘤干细胞比例增加。胶质瘤干细胞被认为是高级别胶质瘤治疗抵抗的根本原因[13]，这从某种程度上解释了复发胶质瘤的生物学行为更加恶性、对治疗的反应性明显降低的原因，与体外实验的研究结果基本一致。复发后的高级别胶质瘤不仅对治疗耐药，而且更具有侵袭性。越来越多研究表明，EMT进程的关键分子ZEB1参与了高级别胶质瘤的复发侵袭过程[14]。本研究中，复发标本ZEB1表达较初治标本高，意味着复发后的胶质瘤更具有侵袭性，这与临床上复发胶质瘤更具有侵袭性、恶性度更高一致[1,15]。更为有趣的是，本研究发现，ZEB1表达与Nestin表达呈正相关，说明高级别胶质瘤在复发的过程中，胶质瘤干细胞不仅比例增高，而且很可能也参与了高级别胶质瘤的EMT进程，与最新的研究成果基本一致[16]。

肿瘤的PFS被认为可在短时间及持续时间内反映肿瘤治疗过程中疾病的进展情况，对评价治疗策略具有重要的临床意义[17]。本研究经单因素分析显示，Nestin表达、年龄、卫星灶及坏死与高级别胶质瘤中PFS有关，与既往研究基本一致[12,18-20]。多因素分析显示，ZEB1表达是影响高级别胶质瘤PFS的独立因素，而年龄、卫星灶、坏死及Nestin表达并不是独立因素。这与有的研究不一样，归结于跟病例选择有关。本研究选择的是配对病例，且KPS>70分，患者均经过手术全切及规范化的放化疗，可能对结果产生一定影响。可见胶质瘤细胞的EMT对肿瘤的复发和侵袭具有重要作用，对临床认识高级别胶质瘤的复发进程具有一定的意义。

综上分析，ZEB1在肿瘤复发标本中的表达较初治标本明显升高，而且是影响高级别胶质瘤PFS的独立因素，ZEB1可能是未来预防高级别胶质瘤复发的一个重要分子。本研究也存在一些不足之处，本研究只停留在免疫组织化学水平，尚缺乏在细胞、动物及分子水平的研究，且标本量偏小。未来的研究应扩充样本量，并开展多水平如细胞、动物和分子水平的研究，以充分验证该研究结果。