糖尿病患者miRNA-29水平与胰岛素抵抗的相关性

罗 艳 胡桂英 李长勇

(武汉市普仁医院，湖北 武汉 430081)

糖尿病(DM)前期指的是一种异常血糖水平，特点为糖耐量减低(IGT)或空腹血糖受损(IFG)，是DM易感者发展为显性2型DM(T2DM)的病理发展过程〔1〕。DM前期发病率非常高，胰岛素敏感指数(ISI)发生变化，而且发展为DM的风险远高于健康人群，若能在此期进行监测、有效延缓或甚至逆转这种异常状态，可能在DM防治中具有重要意义〔2〕。miRNAs是一类长20～25个核苷酸的具有调控功能的非编码RNA，在T2DM在内的多种代谢疾病的发生发展中具有重要作用，可能作为临床应用。而对于T2DM的研究，组织特别是胰腺组织的标本难以获得，但miRNAs能够在外周血中稳定检测到，称为循环miRNAs，对于T2DM的研究具有更为显著的意义〔3〕。研究表明〔4〕，miRNA-29在DM鼠的肝脏和胰腺组织中高表达，可能作为诊断标志物之一，推测为DM的候选基因之一，且其通路与翼螺旋转录因子(FOXA)2密切相关。但miRNA-29在DM发生发展中的具体机制仍待进一步探索，本研究探讨循环miRNA-29水平与胰岛素抵抗(IR)的相关性。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2014年3月至2015年9月武汉市普仁医院内分泌门诊查体或就诊的患者作为研究对象，纳入标准：①自愿参加该项研究并能配合随访；②均接受口服葡萄糖耐量试验(OGTT)：采用2 h，75 g葡萄糖的OGTT试验，患者在空腹口服糖后2 h采集肘静脉血液，检测血浆葡萄糖(PG)含量；③糖耐量评价标准：糖耐量正常为空腹血糖(FPG)<5.6 mmol/L并且餐后2 h血糖(2 h PG)<7.8 mmol/L；空腹血糖受损(IFG)为FPG 5.6～6.9 mmol/L且2 d h PG<7.8 mmol/L；糖耐量减低(IGT)为FPG<5.6 mmol/L且2 h PG7.8～11.0 mmol/L；IFG+IGT为FPG 5.6～6.9 mmol/L且2 h PG 7.8～11.0 mmol/L，初发DM(n-DM)为FPG≥7.0 mmol/L和(或)2 h PG≥11.1 mmol/L。④排除有恶性肿瘤、心脑血管疾病或可能影响miRNA表达的慢性病等患者。本研究经本单位医学伦理委员会批准，且所有受试者签署针对研究的知情同意书。研究分组：将所有纳入对象按照糖耐量试验结果及评价标准分为：糖耐量正常(NGT)组56例，DM前期(pre-DM)组51例和n-DM组58例。

1.2一般资料检测 测量3组受检者的身高、体重、腰围和臀围，计算体重指数(BMI)、腰臀比。在清晨空腹状态下测量血压，连续测量2次，取其平均值，并抽取静脉血，送检验科，检测FPG(氧化酶法，日立7600-020全自动生化分析仪)，检测血脂包括总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(酶法，美国雅培AR-CHTECT C800全自动生化分析仪)，检测糖化血红蛋白(HbA1c，HLC-723G7全自动HbA1c分析仪)，检测空腹胰岛素(FINS，化学发光法)。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5；ISI=1/(FPG×FINS)。

1.3血清miRNA-29及FOXA2 mRNA检测 所用试剂和仪器：Trizol 试剂由美国Invitrogen公司提供，TaqMan MicroRNA反转录试剂盒、miR29、FOXA2 mRNA和U6 TaqMan检测试剂盒(美国Applied Biosystems)。Liofectamine2000(Invitrogen)氯仿、异丙醇和无水乙醇等常规化学试剂为分析纯产品。所有受试者清晨空腹抽取10 ml全血，1 200 r/min离心血清，保存于-80℃冰箱待下一步检测。Trizol法提取血液中总RNA，严格按说明书操作，用TaqMan法进行miR29、FOXA2 mRNA和U6的实时定量PCR检测。PCR反应在Tpersonal PCR仪上进行。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析t检验。相关性采用简单线性相关分析或者偏相关分析，多因素采用多元逐步回归分析。

2 结 果

2.1临床基本指标特征 3组受检者的BMI、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR、ISI、FPG、FINS和HbA1c比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，且这些指标水平在NGT组、pre-DM组和n-DM组中逐渐增加，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2miRNA-29和FOXA2 mRNA的检测比较 miRNA-29在NGT组、pre-DM组及n-DM组中的相对表达逐渐增加，组间差异有统计学意义(P<0.05)；n-DM组血清FOXA2 mRNA明显高于pre-DM组和NGT组，pre-DM组血清FOXA2 mRNA明显高于NGT组(P<0.05)。见表1。

表1 各组受检者临床特征比较

与NGT组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与pre-DM组比较：3)P<0.05

2.3血清miRNA-29与各代谢指标的相关性 在DM人群(n=58)中评估miRNA-29水平与各代谢指标变量之间的关系。结果显示，在DM人群中，血清miRNA-29水平与FOXA2 mRNA、BMI、FINS、TG、FPG和HOMA-IR呈正相关(r=0.553，0.401，0.239，0.420，0.202，0.445，均P<0.05)，与HDL-C和ISI呈负相关性(r=-0.424，-0.354，均P<0.05)，而与年龄和收缩压无相关性(r=0.106，0.098，均P>0.05)。

2.4影响HOMA-IR的多元逐步回归分析 在纳入受检者总队列(n=165)人群中，以HOMA-IR为因变量，血清miRNA-29、FOXA2 mRNA、BMI、TG、TC、HDL-C、LDL-C和HbA1c为自变量，进行多元逐步回归分析。结果显示，影响HOMA-IR的独立危险因素为miRNA-29、FOXA2、BMI和TG(均P<0.05)。见表2。

表2 HOMA-IR水平的多元逐步回归分析

3 讨 论

肝脏作为胰岛素作用的靶器官，在维持体内葡萄糖水平和IR等方面具有重要作用。肝脏可以分泌多种与IR及T2DM发生发展的相关蛋白，如默调节蛋白(SIRT)1〔5〕、线粒体脱耦连蛋白(UCP)2表达〔6〕、fetuin-A〔7〕和血管生成素样蛋白等〔8〕。miRNA是一类与代谢疾病密切相关的微小RNA，已知的与DM及IR相关的miRNA有miRNA-10、miRNA-107和miR-802等〔9～11〕。例如miRNA-29能干扰骨组织中的成骨作用与脂肪化的平衡，最终通过Runx2的脱乙酰化缓解糖皮质激素引起的骨质疏松〔12〕。敲除miRNA-29后，DM鼠的HHDAC4蛋白信号通路被抑制，Nephrin蛋白泛素化，从而增加肾脏足突细胞的紊乱〔13〕。

miRNA-29也与DM发生密切相关，在IR中的作用备受关注，在一些有关IR或DM动物模型中已经得到证实。miRNA-29在糖耐量异常和DM模型鼠的肝脏中表达明显增加，而胰岛素增敏剂使得血清miRNA-29水平回归正常〔14〕。

本研究表明，初诊DM患者血清miRNA-29和FOXA2高于糖耐量异常的人群，糖耐量异常又高于糖耐量正常的易感人群，而此三者人群的HOMA-IR逐渐增大，血糖水平也逐渐上升，推测随着糖耐量异常的程度及HOMA-IR的增加，血清miRNA-29和FOXA2的水平逐渐增加。本研究显示miRNA-29能通过FOXA2途径影响HOMA-IR〔4〕，而且，多元回归分析显示，血清miRNA-29水平是IR和胰岛素敏感的独立影响因素。动物模型研究表明〔15，16〕，miRNA-29参与肝脏细胞转录后调节剂信号转导途径，可能是参与IR水平的重要途径。miRNA-29a首先通过3′UTR区域结合PI3K的亚基p85α，该亚基也是蛋白激酶Akt的上游调节介质，而Akt能通过抑制PEPCK蛋白的表达影响胰岛素的水平。研究显示miRNA-29可能是通过FOXA2途径调节Akt的磷酸化过程，从而影响HOMA-IR〔4，15〕。

本研究也发现，在DM人群中血清miRNA-29水平不仅较易感人群高，而且miRNA-29与BMI、腰臀比和TG呈正相关，说明TG、FPG与IR的关键因素肥胖和BMI密切相关，研究表明〔17〕，miRNA-29在脂肪细胞中能影响胰岛素刺激的Akt磷酸化过程，故推测随着BMI的升高，腹内脂肪面积增加，导致血清游离脂肪酸和TG水平上升，影响了Akt磷酸化过程，从而发生IR。此外，本研究提示FOXA2与miRNA-29呈正相关，即FOXA2随miRNA-29的增加而上调，且FOXA2也是IR的独立危险因素。FOXA2是已经被确认的胰岛素敏感性转录调节因子，参与糖和脂质代谢调节的基因表达〔18〕。研究表明〔19〕，野生型小鼠血浆胰岛素通过核排斥可以抑制FOXA2，而在IR的小鼠中FOXA2持续定位于肝脏细胞中，FOXA2还可以介导Akt的去磷酸化增加肝脏TG的含量，降低肝脏胰岛细胞的敏感性，导致血糖紊乱。而抑制FOXA2磷酸化的药物能促进机体能量消耗，改善血糖，可能达到治疗T2DM或代谢综合征的效果。

本研究也存在很多不足，例如对HOMA-IR指数的评估未能采取金标准-葡萄糖钳夹法，而是采用基础状态的指数-HOMA-IR和ISI，而且，本研究是一个小样本的横断面研究，只能从相关性的角度去探讨，无法完全确认miRNA-29是直接导致IR的危险因素，还是在发生IR或糖耐量异常时代偿性升高，还需要大样本研究及相关基础研究进一步阐明。

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