姜黄素对波动性高血糖处理下人脐静脉内皮细胞DNA氧化损伤的影响

周淑琴 张守法 张 伟 张洪涛

(济南市第四人民医院保健科，山东 济南 250031)

糖尿病可导致多种血管并发症并且是动脉粥样硬化发生的重要危险因素〔1〕。血管内皮细胞在维持血管正常结构及功能方面具有重要作用。动脉粥样硬化多继发于多种因素所致的内皮细胞功能损伤〔2〕。在这些危险因素中，氧化应激的致动脉粥样硬化作用已得到广泛阐释〔3〕。氧化应激即体内活性氧的产生与消除失衡，可导致人体脂质、蛋白及DNA的氧化损伤。目前已知，DNA氧化损伤可致机体核内遗传信息的缺损。当机体抗氧化能力不足时，累及的氧化损伤DNA将导致相应细胞功能的丧失。现有的研究表明，DNA的氧化损伤不仅是动脉粥样硬化的伴随损伤，而是动脉粥样硬化发生发展的重要原因〔4〕。糖尿病患者除了慢性持续性高血糖外，波动性高血糖(IHG)是另一常见的异常血糖状态〔5〕。IHG较持续性高血糖(SHG)更易通过诱导单核细胞黏附至内皮细胞及诱发氧化应激而参与糖尿病血管并发症的发生发展〔6～8〕。姜黄素是一种具有多种生物活性的中药材。抗氧化作用是姜黄素发挥药用作用的重要机制，通过清除氧自由基，改善体内氧化应激状态〔9〕。本研究观察浓度姜黄素对IHG状态下人脐静脉内皮细胞DNA氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1细胞培养及处理 人脐静脉内皮细胞购自上海医学科学院细胞库。传代至10～20代的正常人脐静脉内皮细胞培养于包含11.1 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清pH7.4 RPMI1640培养基，并被置于37℃含5%二氧化碳的培养箱中。实验中，细胞先用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2遍，并被分为不同处理组〔10〕：正常对照(11.1 mmol/L葡萄糖)、SHG(25.0 mmol/L葡萄糖)、IHG(11.1与25.0 mmol/L葡萄糖每隔12 h交替培养)及渗透压对照组，各培养72 h。处理组细胞均保证每日换液一次。在姜黄素保护作用研究中，姜黄素溶于RPMI1640培养基中致终浓度分别为2.5、5.0及10.0 μmol/L。

1.2胞内活性氧的检测 选用2,7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)作为检测探针。不同处理组细胞培养72 h后，先冲洗2次，然后置于含10 μmol/L DCFH-DA的培养基中处理30 min。处理后再次冲洗一遍并将细胞收集于PBS中。用流式细胞仪检测2′,7′-二氯荧光素(DCF)荧光用于计算胞内活性氧浓度。

1.3总抗氧化能力检测 培养细胞上清液中总抗氧化能力的检测基于将Fe3+-TPTZ转化为Fe2+-TPTZ的能力。检测试剂盒购自南京建成并严格按照试剂盒的说明执行。

1.48-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)浓度检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)法完成，试剂盒购自美国OXIS公司。首先应用DNA提取试剂盒提取人脐静脉内皮细胞DNA，并用酶标仪在OD260 nm/OD280 nm定量DNA量。每200 μg DNA溶于50 μl反应混合液中，并在室温下用1 μl DNase Ⅰ消化10 min。消化后的样本置于已包被8-OHdG抗体的检测孔中，于OD450 nm处检测吸光度。

1.5单细胞凝胶电泳 即彗星实验。不同处理后的人脐静脉内皮细胞悬浮于琼脂糖溶液并平铺于玻片上成单细胞层，随后置于4℃冰箱5 min。玻片随后置于预冷的裂解液中去除细胞蛋白，仅留核酸部分。裂解过后，放玻片至电泳槽，置于新鲜电泳液于48℃共20 min。取出玻片，用水冲洗晾干并用EB标记。用荧光显微镜观察拖尾情况。每一标本均选3个不同玻片，每一玻片至少随机计数100个细胞。无拖尾细胞即无DNA氧化损伤细胞。每个玻片均由2个不同人员独立计数，取两者平均值计数彗星率〔11〕。

1.6统计学处理 采用SPSS12.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1细胞内活性氧的含量变化 与正常培养状态的细胞相比，SHG培养细胞胞内活性氧水平升高约160%，而IHG处理细胞具有更高的活性氧水平(P<0.01)。姜黄素可剂量依赖性减轻IHG所致内皮细胞胞内活性氧的水平(P<0.01)，见表1，表2。

2.2内皮细胞DNA氧化损伤 高血糖处理细胞内具有更高水平的8-OHdG水平，且在IHG处理组更明显(P<0.01)。姜黄素可剂量依赖性地减轻IHG所致内皮细胞胞内8-OHdG的水平(P<0.01)。类似的结果同样发现于彗星实验：与正常培养细胞相比，SHG与IHG培养细胞分别具有约2.0倍与3.1倍高的DNA氧化损伤(P<0.01)，而姜黄素可显著减轻上述病理损伤(P<0.01)，见表1，表2。

2.3胞内总抗氧化能力的含量变化 与正常培养细胞相比，高血糖培养细胞具有较低的总抗氧化能力，且IHG组更明显(P<0.01)。而姜黄素可剂量依赖性地改善IHG所致内皮细胞总抗氧化能力的降低(P<0.01)，见表1，表2。

表1 IHG加重人脐静脉内皮细胞氧化损伤

与正常对照组：1)P< 0.01，下表同

表2 姜黄素剂量依赖性的减轻IHG所致人脐静脉内皮细胞氧化损伤

3 讨 论

本实验发现IHG较SHG更易导致内皮细胞DNA氧化损伤及抗氧化功能失调。同时，姜黄素可剂量依赖性地改善高血糖所致内皮细胞DNA氧化损伤。活性氧产生于氧代谢过程，是血管发育不同阶段中一种重要的调节因子〔12〕。然而，氧化与抗氧化的失衡将导致体内氧化应激的产生。在氧化应激状态下，胞内重要的生物分子包括脂质、蛋白及DNA等均会出现损伤并进而参与许多病理损伤的发生〔13〕。比如，持续过量的活性氧产生及DNA氧化损伤的积累被认为参与动脉粥样硬化的发生与发展〔4〕。

通常，糖尿病患者内皮功能失调被更多关注于SHG的毒性作用。在正常人体中，血糖被严格控制在一个较窄的范围内。然而，糖尿病患者由于自身调节血糖能力的不足，血糖水平通常在1 d内表现为较大幅度的变化，而这种变化通常伴随氧化应激的产生〔5〕。目前已有部分研究发现SHG更易诱导内皮细胞凋亡，并上调黏附分子与炎性因子的表达〔6，8，14，15〕。然而，IHG致内皮细胞DNA氧化损伤的潜在毒性作用却缺乏相关研究。

总抗氧化能力被广泛用于检测反映组织细胞氧化应激状态〔16〕。因而，本研究结果证实IHG可致更严重的内皮细胞DNA氧化损伤，且这一毒性作用基于胞内总抗氧化能力的降低。姜黄素具有较强的抗氧化活性〔9〕。本课题组既往的研究发现姜黄素通过其抗氧化作用可减轻缺血再灌注所致兔脊神经的损伤〔17〕。本研究结果证实姜黄素可同时减轻SHG与IHG所致内皮细胞DNA氧化损伤。IHG所致内皮细胞DNA氧化损伤的机制至少部分类似于SHG的毒性作用，且其毒性作用更为明显。目前，IHG更高毒性作用的具体机制尚不明确。一种可能的解释是在慢性高血糖状态下，机体组织细胞逐渐适应并据此调整机体功能以适应这种变化。而IHG将减缓这种自身调节机制进而导致更严重的毒性作用〔10〕。

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