猪圆环病毒2 型吉林分离株的全基因组序列分析

苗丽娟, 刘东旭, 尹柏双

(1.吉林农业科技学院动物科技学院, 吉林 吉林132101 ;2.预防兽医学吉林省重点实验室, 吉林 吉林132101)

猪圆环病毒2 型(PCV2 ) 隶属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员,是迄今为止发现的最小的动物病毒之一[1],是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等相关疾病的主要病原[2],PCV2 可引起免疫抑制,继发其他疾病感染,给养猪业造成巨大的经济损失。

PCV2 包括不同亚型,有PCV -2a,PCV -2b,PCV-2c,PCV -2d[3]四种亚型,试验表明,病理症状的不同,毒株之间的差异比亚型之间的差异更重要。 PCV2 隐性感染一直存在,本课题组主要进行猪病毒病的分子诊断,对于送检的阳性病料进行分离培养,2017 年3 月从送检到我实验室的阳性猪体上分离出一株PCV2,命名为PCV2 -2017。 本试验通过对PCV2 基因组序列的测序分析,为该病的防治提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 毒株 2017 年从吉林省某猪场送检的病猪分离出1 株PCV2,命名为PCV2 -2017。

1.2 主要试剂 DNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒,购自康为世纪生物科技有限公司;Taq DNA 聚合酶(含10 ×Buffer 25 mmo1/L MCl2)、 dNTP、pMD18-T 宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 方法

1.3. 1 引物的设计与合成 根据GenBank 中PCV2 保守区进行全基因组序列,设计了4 对引物,引物序列见表1,引物由长春库美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2 DNA 的提取 按照Universal Genomic DNA Kit 试剂盒操作说明书,从细胞培养液中提取病毒基因组中DNA,用适量的TE 溶解, -20 ℃,保存备用。

1.3.3 PCV2 全基因组的扩增、克隆和测序 应用Oligo 6.24 软件设计的PCV2 4 对引物, PCR 的反应体系为25 μL,1 μL 的up/low(20 pmol/μL)、3 μL dNTP(2. 5 mmol/μL),2. 5 μL 的10 × Buffer、0.25 μL的r Taq 酶、14.25 μL 的灭菌水,反应条件为35 个cycle,预变性94 ℃5 min 后,进入循环94 ℃50 s,56 ℃1 min 30 s,72 ℃50 s,72 ℃延伸7 min。 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带,将目的基因与pMD -18T 载体连接转化,将鉴定后阳性菌送长春库美生物工程有限公司测序。

表1 扩增PCV2 全基因序列的引物

1.3.4 PCV2 全基因组、Rep、Cap 和ORF3 基因的序列比对分析 采用DNAStar 软件进行序列拼接,使用MegAlign 将PCV2 -2017 与GenBank 中收录的PCV2 的国内外参考毒株的全基因组序列、ORF1、ORF2 基因、ORF3 基因变异性和同源性进行分析,分析其遗传进化关系,参考毒株见表2。

表2 进化分析采用的参考毒株

2 结果

2.1 全基因组序列分析 用DNAStar 软件将测得的序列进行拼接,结果表明,PCV2 -2017 毒株全长1 767 bp。 核酸同源性分析表明,与法国株AF055394同源性最高,可达99 %,与美国株AF055391、四川株HM102350 同源性最低,为96%。 用MegAlign 分析PCV2-2017 毒株与GenBank 中收录的其他PCV2 毒株的遗传进化关系,结果见图1,由图1 可以看出,PCV2 毒株可以分为2 个分支,其中1 个分支中AY322001、AB426905 和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393 毒株亲缘关系较近;PCV2 -2017 新分离株与HM102350、JQ809464、GU124593、AF055394、AF055391、GU325757、JX512856 组成第2个分支,与法国株AF055394 亲缘关系最近,同属于PCV-2b 亚型,与JQ809464、HM102350、GU124593 亲缘关系也较近。

2.2 ORF1 和ORF3 基因序列变化和同源性分析 PCV2 -2017 毒株中ORF1 基因全长946 bp,编码Rep 蛋白,GenBank 上核酸和氨基酸同源性分析,结果同源性都为99%,在867 nt C 变为T,导致丙氨基酸变为缬氨基酸。

PCV2 -2017 毒株中ORF3 基因长为315 bp,核酸同源性比对结果为100%,ORF3 编码的蛋白,与病毒在机体内的致病性和病毒诱导细胞凋亡有关,说明该蛋白比较保守。

图1 部分PCV2 基因组序列构建的遗传进化分析PCV2 -2017 本试验新分离株

2.3 ORF2 基因的序列变化和分析 PCV2 -2017新分离株中Cap 基因长度为702 bp,编码Cap 蛋白,在GenBank 中进行核酸同源性比对,核苷酸同源性在96% ～99%之间;氨基酸同源性比对,同源性在94% ～99%之间,说明PCV2 变异主要发生在ORF2区,共有12 个点突变,突变主要集中在670 nt ～680 nt 之间,有4 个位点突变,其余分散于ORF2 的其他位置,部分结果如图2 所示。 导致相应的氨基酸也发生改变,这是否导致抗原性发生改变还需要进一步研究。

图2 PCV2 -2017 吉林株ORF2 核酸序列部分对比结果

3 讨论与分析

通过本试验获取吉林新分离株PCV2 -2017,并对全基因组结构进行序列分析。 本次获得PCV2 基因组全长1 767 bp,与PCV-2b 亚型参考株AF055394亲缘关系最近,所以属于PCV-2b 亚型,2003 年以前PCV-2a 为主要的流行毒株,现在PCV-2b 为流行的主要毒株[4-6]。

PCV2 -2017 ORF1 经过测序拼接后长度为946 bp, ORF1 编码Rep 蛋白,仅在867 nt 位置C 变为T,导致272 aa 变异,由丙氨基酸变为缬氨基酸,对其功能是否有影响还需要进一步探究,Rep 蛋白与病毒的复制相关,比较保守;ORF3 长度为315 bp,编码的蛋白与病毒的致病性有关,能诱导细胞凋亡;ORF2 测序拼接后长度为702 bp,编码Cap 蛋白,Cap 蛋白是PCV2 的主要结构蛋白,与病毒的致病性和抗原表位有关,具有较大的变异性,是刺激机体产生免疫保护应答的重要靶抗原。