奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌ESBLs 基因型分布特征

张颖欣, 陈友涵, 李树梅, 程 佳, 韩 博, 高 健

(1.中国农业大学动物医学院, 北京 海淀100193 ;2.北京实验动物研究中心, 北京 朝阳100012)

近年来,环境型致病菌引起的奶牛乳房炎比例 逐渐升高[1]。 肺炎克雷伯菌作为常见的环境型致病菌,引发的乳房炎症状尤为严重,具有发病急、死淘率高、奶量下降严重、抗生素治疗效果不佳等特点[2-4],给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。 随着β-内酰胺类抗生素在奶牛场的广泛使用,产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)的菌株不断出现。 ESBLs 是一类由质粒介导,能水解氧亚氨基β-内酰胺类抗生素的酶,对碳青霉烯类和头霉素抗生素敏感,其活性可被克拉维酸、舒巴坦所抑制。 ESBLs 家族数量庞大,最常见的三种基因型为blaTEM、blaSHV和blaCTX-M[5]。 相较于其他革兰阴性菌,肺炎克雷伯菌在环境中存活时间更长;因此,更易产生携带ESBLs 基因的菌株,并且不断进化[6]。 产ESBLs 型克雷伯菌往往具有多重耐药的特点,并能够将耐药性迅速地转移。 因此,必须对其进行监控,并制定相应的防控策略。

目前,已经有产ESBLs 型大肠杆菌在我国奶牛场流行情况的相关报道[7-8]。 作为同样重要的环境型致病菌,产ESBLs 的肺炎克雷伯菌在全国范围内规模化牛场中的流行状况还不得而知。 据悉,仅有一篇区域性报道[9],涉及的牛场数和样本量较少。因此,本试验旨在全国范围内调查产ESBLs 型菌株在奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌中流行情况;并对其基因亚型进行鉴定,为综合防控肺炎克雷伯菌性乳房炎提供流行病学数据。

1 材料与方法

1.1 菌株 2015 年至2016 年间,于全国77 个大型规模化奶牛场中分离鉴定了124 株临床乳房炎源性肺炎克雷伯菌,这些奶牛场分布于河北、河南、黑龙江、内蒙古、北京、天津、甘肃、江苏、安徽、上海、陕西、辽宁、山东等13 个省份。 质控菌株大肠杆菌ATCC25922,购自广东环凯生物科技有限公司;肺炎克雷伯菌ATCC700603,购自温州康泰生物科技有限公司。

1.2 试剂 LB 肉汤、伊红美蓝琼脂;购自北京奥博星生物技术有限责任公司;Mueller-Hinton 琼脂(MHA);购自北京陆桥生物技术有限责任公司;头孢噻肟30 μg、头孢噻肟/克拉维酸30/10 μg、头孢他啶30 μg、头孢他啶/克拉维酸30/10 μg 药敏纸片;购自北京天坛药物生物技术开发公司;细菌基因组DNA 提取试剂盒;购自北京华泰博奥生物科技有限公司;2 ×Taq supermix;购自北京康为世纪生物科技有限公司;DL-2 000 DNA Marker;购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 ESBL 表型确证 根据CLSI 推荐的纸片扩散法进行操作：无菌生理盐水调节待测菌液至0.5 麦氏浊度,将菌液均匀地涂布在MHA 平板,贴头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸的药敏纸片,每个纸片至少相隔24 mm,于37 ℃培养16 ～18 h。 若两组中任何一组药物,在加克拉维酸后与其对应不加克拉维酸的抑菌圈相比,增加值≥5 mm,被判定为产ESBLs 菌株[9]。 质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603(阳性对照株)和大肠埃希菌ATCC25922(阴性对照株)。

1.4 ESBLs 基因型检测 使用细菌基因组DNA 提取试剂盒(北京华泰博奥生物科技有限公司)提取DNA,严格按照说明书进行操作。 参照MA 等[10]合成ESBLs 编码基因引物,由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。 反应条件：95 ℃预变性5 min,随后95 ℃变性1 min,51 ℃退火1 min(blaSHV型退火温度为55 ℃,blaCTX-M型退火温度为56 ℃),72 ℃延伸1 min,循环35 次,循环结束后72 ℃延伸10 min。 阳性PCR 产物送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序,将得到的序列信息在GenBank 数据库比对。

2 结果

2.1 产ESBLs 型肺炎克雷伯菌流行率 所检测的124 株肺炎克雷伯菌株中,有17 株肺炎克雷伯确证为产ESBLs 菌株,流行率为13.7%(17/124)。

2.2 ESBLs 基因型分布 对17 株确证为产ESBLs型肺炎雷伯菌进行PCR 扩增,有14 株扩增出阳性条带,3 株未扩增出以上3 种基因型。 其中,有6 株菌属于blaCTX-M基因型,10 株菌属于blaSHV基因型,5 株菌属于blaTEM基因型。 测序结果显示,所有的blaCTX-M基因型均为blaCTX-M-14亚型;blaSHV基因型菌株中,7 株为blaSHV-1亚 型,各1 株分 别 属 于blaSHV-11、blaSHV-26和blaSHV-28亚型;所有的blaTEM基因型均为blaTEM-1亚型。检测结果还显示,有3 株肺炎克雷伯菌同时携带2 种β-内酰胺酶编码基因,组合方式为blaSHV-1+blaCTX-M-14;有2 株肺炎克雷伯菌同时携带了3 种β-内酰胺酶的编码基因,组合方式为blaTEM-1+blaSHV-1+blaCTX-M-14。 菌株ESBLs 基因型分布情况列于表1。

表1 肺炎克雷伯菌(n=17)ESBLs 基因型分布

3 讨论

本试验报道了来自国内13 个省份的77 个大型规模化奶牛场中产ESBLs 型肺炎克雷伯菌的流行状况,流行率(13.7%)低于来自国内的另一报道(42.0%)[11]。 然而,参考报道中的菌株仅来源于宁夏地区奶牛场,收集区域、牛场数及菌株数均有一定局限性[11];而本报道则探查了全国范围规模化奶牛场中产ESBLs 肺炎克雷伯菌的流行状况,这在国内尚属首次。 来自人医领域的报道显示,人源性肺炎克雷伯菌产ESBLs 菌株阳性率为29.9% ～44.9%[12-14]。

ESBLs 多由质粒介导,可通过转化、转导等方式在肠杆菌科细菌之间传播,国内已有不少关于产ESBLs 型大肠杆菌在奶牛场流行情况的报道。 王桂琴使用和本试验相同的方法对内蒙古呼和浩特市和上海市奶牛场分离的大肠杆菌进行调查,发现ESBLs 阳性率为10.3%[16];Ali 等收集中国16 个省份共1 252 株乳房炎大肠杆菌进行检测,发现有23.5%的大肠杆菌具有ESBLs 表型[8];赵俊利调查内蒙古奶牛源沙门菌耐药菌的ESBLs 分布情况,报道阳性率为85.7%[17]。 研究显示,ESBLs 在体外的活性会下降,故体外检测所得的ESBLs 流行率可能低于真实水平[18]。 因此,奶牛场的肺炎克雷伯菌的实际耐药状况可能比本调查结果更为严峻,兽医以及相关管理人员对应予以重视,合理地使用抗生素。

本次调查发现,在产ESBLs 型肺炎克雷伯菌中,存在blaCTX-M、blaSHV和blaTEM三个基因型;其中,blaCTX-M-14、blaSHV-1和blaTEM-1是最常见的亚型。 刘保光等报道,我国鸡源性肺炎克雷伯菌的常见ESBLs亚型为blaCTX-M-14、blaTEM-1、blaSHV-11型,其中blaCTX-M-14型检出率最高[19],与本试验结果相符。 人源性肺炎克雷伯菌常见的ESBLs 亚型为blaCTX-M-14、blaCTX-M-3和blaSHV-12[20],其中blaCTX-M-14占比最高,与本次试验结果一致。 此外,共有3 株产ESBLs 型肺炎克雷伯菌不能确定基因型,可能是由于ESBLs 家族数量庞大,而本试验只选取了最常见的3 种ESBLs 基因型进行检测,这些菌株可能属于其他基因型。

此外,研究还发现了携带两种及以上不同类型β-内酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌。 不同类型β-内酰胺酶对不同抗生素水解能力具有差异,因此,耐药基因的整合会增加肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药性,最终增加临床治疗的难度。 以上研究结果提示我们,应做好对ESBLs 菌株监控,预防多重耐药细菌产生。