滋肾降糖丸对糖尿病性骨质疏松大鼠骨密度及骨形态学的影响*

★楚淑芳 赵恒侠 刘德亮 刘雪梅 渠昕 李增英 李金花 刘玲 李惠林*（深圳市中医院 广东 深圳 518033）

糖尿病（diabetes mellitus， DM）已成为世界范围的严重危害人们健康的疾病，据国际糖尿病联盟统计，到2030年，全球将有5.52亿人受到糖尿病的困扰。到2030年，全球将有5.52亿人受到糖尿病的困扰。目前，我国已成为仅次于印度的糖尿病第二大国［1］。糖尿病性骨质疏松（diabetic osteoporosis， DOP）是一种常见的糖尿病并发症，其主要症状除糖尿病及其他并发症症状之外，还伴有髋部、腰骶部等部位疼痛或持续性肌肉疼痛等表现，并且容易发生骨折。其主要病理改变为单位体积内骨量减少，骨强度减弱、脆性增加等。流行病学资料显示，在DM患者中，DOP的发病率可达60%［2］，DM是OP发展的一个重要因素［3］。目前DOP的治疗，主要以抗骨质疏松药物治疗为主，然而此类药物治疗效果仍存在争议，且价格昂贵，有些患者对其副作用不能耐受。由此，中药的抗骨质疏松作用逐渐受到重视。

糖尿病归属中医学“消渴”范畴，而中医文献无骨质疏松症病名，目前多数医家认为描述较准确者应属“骨痿”，《丹溪心法》中就有两者相关性的论述：“消肾，肾虚受之，腰膝枯细，骨节酸疼。”现代医家通过多年的实验及临床研究证明了肾虚、血瘀、痰湿是消渴与骨痿并发的重要病机。中医药对于其治疗主要是在补益脾肾基础上合以益气养阴、活血化瘀通络之法。滋肾降糖丸是深圳市中医院自行研发的中药复方，具有益气养阴，滋肾壮骨的作用，符合从“肾主骨”理论入手治疗骨质疏松。前期研究发现，滋肾降糖丸不仅具有良好的降糖、调脂、提高胰岛素敏感性等作用，而且体外研究发现其可发挥多靶点抗骨质疏松作用，但作用机制不明，因此需要对其进一步研究。因此，本课题首先建立DOP的动物模型，进行不同剂量滋肾降糖丸的干预治疗，对其骨密度（bone mineral density，BMD）、骨组织形态学进行研究。

1 实验材料

2月龄SPF级健康雄性Wistar大鼠60只（合格 证 号：44002100006561），体 重 160～190g，购自南方医科大学实验动物中心。动物饲养于深圳市疾病预防控制中心SPF级动物房，环境温度18℃～22℃，自然昼夜节律光照（12h：12h），自由饮水、摄食，环境湿度40%～70%；SPF级大鼠饲料购自广东省医学实验动物中心。

滋肾降糖丸：由深圳市中医院药学部制备，组成成分主要有黄芪、生地黄、熟地黄、淫羊藿、五味子、仙茅、仙灵脾、狗脊、鳖甲、龟板等，滋肾降糖丸（批号：粤Z20070085）用温热蒸馏水融化，并浓缩成含生药1g/mL。实验时用0.5%

羧甲基纤维素钠配成所需要浓度的混悬液。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）购自美国Sigma公司。

双能X线骨密度仪（GE，美国），BX61显微镜（OLYMPUS，日本），sp1600硬组织切片机（Leica，德国），Tissue-Tek DRS 2000染色机（SAKURA，日本）。

2 实验方法

2.1 模型制作与实验分组 大鼠适应性喂养2周（标准饮食），随机取10只作为正常对照，余50只为模型组。所有大鼠禁食12h后，造模组按60mg/kg剂量腹腔注射0.2%STZ（稀释液为0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值4.5），正常对照组腹腔注射相同量的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH值4.5）。采用血糖仪测给药后72h大鼠尾静脉血糖值，选取空腹血糖＞16.7mmol/L者，普通饲料喂养2周后同样方法再次测量空腹血糖仍＞16.7mmol/L认为造模成功。造模成功者共30只，随机分为模型组、中药高剂量组（3.0g/kg）、中药低剂量组（1.5g/kg）。加正常组，共4组，每组10只大鼠。造模成功后次日开始治疗，治疗方案如下。

正常组与模型组予0.5%羧甲基纤维素钠10mL/kg/天灌胃；中药高、低剂量组按不同的浓度（中药高剂量组浓度为3.0g/kg、中药低剂量组浓度为1.5g/kg）给予10mL/kg/d灌胃。治疗疗程为3个月。处理结束后行双能X线检查。1周后，所有大鼠禁食12h，戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉采血处死，取骨组织固定及-80℃冰箱保存备用。

2.2 骨密度检测 各组大鼠治疗结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，应用双能X线骨密度仪及小动物专用软件检测分析骨密度，测量参数为双能电压41kVp和100kVp，扫描窗宽18cm，扫描速率4.8s/cm，处死前进行全身骨密度、股骨以及腰椎骨密度测量。

2.3 骨硬组织切片及HE染色

2.3.1 硬组织切片 取股骨髁样本，去除骨膜及软组织，修整；立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定；清水冲洗24h；以75%、85%、95%、100%梯度乙醇脱水；放入无水丙酮以置换组织中的乙醇；以聚甲基丙烯酸甲脂（PMMA）包埋；以硬组织切片机与植入体垂直横行截面、切片；砂纸磨片至50μm。

2.3.2 HE染色 二甲苯5min，二甲苯3 min，100%酒精30s，100%酒精30s，95%酒精30s，90%酒精 30s，自来水洗 10～30s，苏木素染色 10～15min，流水洗20秒，1%盐酸酒精分化切片10s，流水冲洗15min，1%伊红染色3min，90%酒精30s，95%酒精30s，95%酒精30s，100%酒 精30s，100%酒精30s，100%酒精30s，石炭酸二甲苯30s，二甲苯30s，二甲苯30s，二甲苯30s；中性树胶封片。

2.4 统计学处理 所得数据应用State12.0软件进行统计学分析、处理，计量资料数据以均数±标准差表示。计量资料组内比较采用配对t检验，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料采用χ2检验。各组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较用Bonferroni检验。以P＜0.05表示有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠不同部位骨密度（Bone mineral density，BMD）的比较 经单因素方差分析知，各组大鼠全身BMD之间差异有统计学意义（P＜0.05），进一步行Bonferroni检验得，正常组与模型组、中药高剂量组与模型组之间差异有统计学意义（P＜0.05），而中药低剂量与模型组、中药低剂量与中药高剂量之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。对于脊柱及股骨BMD，经统计学分析得各组大鼠脊柱BMD之间差异有统计学意义（P＜0.05），经Bonferroni检验可知，模型组与正常组，中药高、低剂量组与模型组之间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠不同部位BMD（，n=10） g/cm2

表1 各组大鼠不同部位BMD（，n=10） g/cm2

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

分组 全身 脊柱 股骨正常组 0.18±0.014 0.16±0.012 0.18±0.013模型组 0.13±0.008** 0.11±0.007** 0.13±0.013**中药高剂量组 0.15±0.006▲ 0.12±0.006▲ 0.14±0.005▲▲中药低剂量组 0.14±0.011 0.13±0.01▲▲ 0.15±0.015▲

3.2 骨硬组织切片HE染色

图1 各组大鼠股骨硬组织切片（HE染色，×200）

由图1可以看出，正常组骨小梁分布均匀，排列整齐（图A）；而模型组骨小梁结构变细，排列疏松，甚至大片区域骨小梁缺失（图B）；而中药高剂量组骨小梁分布均匀，排列尚可，骨小梁较模型组粗大、均匀（图C）；中药低剂量组骨小梁结构较模型组亦有改善，数目较模型组增多，排列较模型组整齐（图D）。

4 讨论

本课题主要从骨密度、骨组织形态学方面对滋肾降糖丸的抗骨质疏松作用进行了系统研究。现代医学认为骨质疏松是一种以骨量减少及骨组织微结构退化为主要表现的骨骼代谢疾病，其导致骨强度降低，骨脆性增加，易致骨折［4］。在本实验研究中，应用DEXA检测后发现，模型组大鼠骨密度明显下降（P＜0.05），而经过滋肾降糖丸治疗后，DM大鼠的全身、腰椎及股骨骨密度明显提高（P＜0.05）。

DOP除了骨量减少的因素外，还与骨结构因素和骨内微损伤的数量有关，骨微损伤存在于活体骨中并影响骨组织微结构性质和功能［5］。骨小梁退行性改变与显微骨折导致了骨小梁结构强度下降，因此骨显微结构的改变可以更直接地反映骨质疏松情况。在本实验中，骨硬组织切片HE染色结果则提示糖尿病大鼠骨皮质变薄，骨小梁数目及面积减少，部分断裂，结构不连续；而经高、低剂量滋肾降糖丸治疗后，糖尿病大鼠骨形成明显活跃，松质骨与皮质骨骨量明显增加，骨密度升高，同时骨组织形态获得显著改善，骨量丢失得到抑制。

本课题以腹腔注射大剂量STZ构建T1DM模型，此种方法诱导的T1DM动物模型已被证实可导致低骨形成，诱导后8～12周可出现骨量减少［6-7］，我们的前期的预实验通过腹腔注射60mg/Kg 0.2%STZ成功构建T1DM动物模型后，普通饲料喂养8周后检测血清骨形成及骨吸收标志，测大鼠全身、脊柱及股骨骨密度，行股骨下段HE染色，均证实了此模型可以诱导骨质疏松。成功构建DOP模型后，给予不同剂量滋肾降糖丸治疗，经治疗3个月后，治疗组大鼠骨密度得到明显改善，，同时骨组织形态获得显著改善，骨量丢失得到抑制。Silva等［8］的研究也表明，STZ诱导的T1DM大鼠骨小梁骨密度逐渐丧失，皮质骨生长过早停止，骨整体硬度和强度的降低导致骨干转动力矩的降低。骨材料强度略有下降也可导致整体骨强度的降低，和非酶胶原交联增加有关，故得出结论：T1DM短期内占主导作用的是改变骨结构而非骨骼质量。这和我们的研究结论相符合。

滋肾降糖丸是我院自行研发的中药复方，具有益气养阴，滋肾壮骨的作用，符合从“肾主骨”理论入手治疗骨质疏松。课题组前期研究发现，滋肾降糖丸降糖具有明确的降糖调脂作用，并且能使胰岛素敏感性提高，同时还能够抗氧化，保护血管内皮，降低炎症因子水平等作用［9-12］。更重要的是，在抗骨质疏松方面，体外研究发现，滋肾降糖丸含药血清能通过下调人脂肪酸结合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4， FABP4）及氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferators-activated receptors γ2，PPAR γ2）表达抑制小鼠骨髓间质干细 胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂分化，上调RUNX2和BMP-2基因表达，促进BMSCs成骨分化，从多靶点发挥抗骨质疏松作用［13-14］。而本实验通过观察不同浓度滋肾降糖丸对DOP大鼠骨密度及骨组织形态学的影响，从组织形态学角度证明了其抗骨质疏松作用，但对于其具体机制还需要更深入的研究，比如随着现代生物学的发展，可以应用基因组学、蛋白质组学、代谢组学等系统生物学研究方法对其进行更深入的研究，加之计算机、数学等学科的协助以及生物信息学的不断发展和完善，给中医药复方研究带来了新的思路和方法。综上所述，滋肾降糖丸可以提高DOP大鼠的骨密度，改善骨组织形态，从而发挥其抗骨质疏松作用，对于其可能的机制需进一步研究。

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