益肾蠲痹丸对破骨细胞-调节性T细胞共培养体系中破骨细胞分化及功能的影响❋

郭明慧，徐慧慧，李晓亚，王 贵，黄 晶，吕 爽，路相臣，赵宏艳，肖 诚

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2. 中日友好医院临床医学研究所，北京 100029； 3. 中国医学科学院/北京协和医科大学，北京 100193； 4. 中国中医科学院医学实验中心，北京 100700)

骨骼处于不断更新的动态平衡中，重复着骨吸收-骨形成的过程，免疫系统能影响骨组织的动态平衡[1]。调节性T细胞(regulatory t cells，Tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，与自身免疫性疾病的发生关系密切，增强Tregs细胞的活性有助于治疗类风湿关节炎(RA)诱发的骨丢失[2]。破骨细胞(osteoclast，OC)在骨破坏的过程中发挥着重要的作用。有证据表明，Treg细胞可以在体外和体内抑制OC分化，这与其通过分泌转化生长因子β(TGF-β)、白介素(IL)-10和IL-4调节破骨细胞生成有关。Tregs不仅通过细胞因子途径发挥对OC的抑制作用，还可通过直接接触途径抑制破骨细胞分化及功能[3-4]，因此本课题组建立了OC-Tregs共培养体系[4]。益肾蠲痹丸(YSJB)是著名医家朱良春先生的名方，可以调节RA患者的免疫功能，临床疗效显著[5-6]。本研究通过此建立的OC-Tregs共培养体系，探讨益肾蠲痹丸对共培养体系中OC分化及功能的影响。

1 材料

1.1 动物

6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，饲养于首都医科大学附属安贞医院清洁级实验动物室(实验动物使用许可证号SCXK(京)2016-0002)。6周龄雄性SD大鼠，由中国食品药品检定研究所提供，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所(实验动物使用许可证号SCXK(京)2016-0021)。

1.2 药品及主要试剂

YSJB由江苏正大清江制药公司提供；来氟米特(LEF)，苏州长征-欣凯制药有限公司提供。α-MEM培养基、RPMI-1640培养基，美国Hyclone公司；青霉素、链霉素，美国Gibco公司；FBS胎牛血清，美国BioTech公司；小鼠重组核因子κв受体活化因子配基(RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、小鼠重组IL-2，美国Peprotech公司；小鼠TGF-β1，美国R&D公司；抗小鼠CD3抗体、抗小鼠CD28抗体，美国BD公司；小鼠CD4+T细胞预富集试剂盒、小鼠CD25+T细胞分选试剂盒、Blocking Solution，加拿大Stemcell公司；甲苯胺蓝、抗酒石酸磷酸酶(TRAP)试剂盒，美国Sigma公司；牛骨片，英国Immunodiagnostic Systems Limited公司；小鼠IL-10 ELISA试剂盒，法国Diaclone公司；小鼠高迁移率族蛋白1(HMGB1)ELISA试剂盒，美国Chondrex公司；总RNA提取试剂盒、PrimeScriptTMRTreagent Kit试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR试剂盒，日本Takara公司。

1.3 主要仪器

二氧化碳细胞培养箱、NanoDrop 2000C超微量分光光度计，美国 Thermo Scientific 公司；PCR仪，美国 Bio-RAD公司。

2 方法

2.1 制备含药血清

40只6周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为假免疫组、CIA 组、CIA+LEF组、CIA+YSJB 4组各10只，采用Ⅱ型胶原免疫制作CIA模型免疫2周后， LEF组灌服LEF(2.15 mg/kg/d)，每日1次，连续灌胃给药3 d，YSJB组灌服YSJB(3.702 g/kg/d)，每日2次，连续灌胃给药3 d；末次给药1 h 后，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血，静置 1 h 后离心，分离血清是为含药血清。CIA 组和假免疫组灌服等容积的蒸馏水，按以上程序分离血清，所取血清分别为 CIA 组血清和假免疫组血清。血清于-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 Tregs-OC共培养体系的建立

2.2.1 破骨细胞前体细胞的分离与培养 C57BL/6 小鼠脱颈处死，无菌分离股骨、胫骨，收集骨髓细胞悬液，用含20ng/ml M -CSF 的 α -MEM 培养液(含10% FBS、100U/ml 青霉素、100μg/ml链霉素)接种于培养瓶中。24 h后收集未贴壁细胞，以1×105个/孔加入96 孔培养板内，5×105个/孔加入24孔培养板内。培养3 d后得到破骨前体细胞。

2.2.2 CD4+CD25+Tregs的诱导激活 C57BL/6 小鼠脱颈处死，无菌分离脾脏制备脾细胞悬液，将细胞浓度调整至1×108个/ml，用小鼠CD4+T细胞预富集、小鼠CD25+T细胞分选试剂盒及磁珠分选器进行分选，用分化培养液(RPMI-1640培养基+2 μg/ml抗小鼠CD28+1000 U/ml IL-2+10 ng/ml TGF-β+10%FBS+100 U/ml 青霉素、100 μg/ml链霉素)重悬细胞，接种于用抗小鼠CD3(10 μg/ml，50 μl/孔)包被过的圆底96孔板内，此为诱导成功的Tregs，阳选的CD4+CD25+Tregs用于进行后续实验。此为本课题前期摸索的实验方法，经流式细胞术鉴定Tregs表型[4]。

2.2.3 OC-Tregs共培养体系的建立 按前期方法[4]，将M-CSF预诱导3 d后的破骨前体细胞与诱导激活后阳选的Tregs以1∶25比例加入96孔/24孔板内，建立共培养体系，所采用的培养液为OC分化培养基(20 ng/mlM-CSF、100ng/mlRANKL、10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml链霉素的α-MEM培养基)。

2.3 共培养体系中破骨细胞分化及骨吸收功能的检测

按上述方法，将M-CSF预诱导3 d后的破骨前体细胞与诱导激活后阳选的Tregs以1∶25的比例加入96孔板内(孔板内预置盖玻片或牛骨片)，第3天加入10%含药血清，分别是假免疫组血清(OC+Tregs+Control组)、CIA模型组血清(OC+Tregs+CIA组)、CIA+LEF组血清(OC+Tregs+LEF组)、CIA+YSJB组血清(OC+Tregs+YSJB组)，隔日半量换液，保持含药血清浓度不变。培养第6天，TRAP染色后倒置相差显微镜下计数96孔板内TRAP染色阳性的OC(细胞核≥3)数目；培养至第12天，取出牛骨片进行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察骨吸收陷窝形态，用Leica Qwin图像分析系统分析骨吸收陷窝面积。

2.4 共培养体系上清中IL-10和HMGB1含量的检测

培养至第6天取各组的培养上清，采用ELISA法测定细胞上清中IL-10和HMGB1的含量。

2.5 共培养体系中HMGB1、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)和IL-10基因表达的检测

表1显示，培养至第6天，采用Real-time PCR法检测Tregs中的IL-10mRNA和OC内的HMGB1、RAGE mRNA表达水平。各组细胞按Takara RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA，并测定总RNA纯度和浓度，根据总RNA用PrimeScriptTMRTreagent Kit试剂盒合成cDNA。引物根据基因库同源基因序列进行设计，由上海生工合成。Real-time PCR 步骤按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR试剂盒说明书进行，扩增条件为95 ℃变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，扩增45个循环，实验数据由PCR检测仪收集，按照2-△△ct相对定量公式计算各组目的基因表达量。

表1 引物序列

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 益肾蠲痹丸对OC-Tregs共培养体系中破骨细胞分化及骨吸收功能的影响

表2图1显示，与OC+Tregs+Control组比较，OC+Tregs+CIA组、OC+Tregs+LEF组、OC+Tregs+YSJB组OC数目及骨吸收陷窝面积明显增加(P<0.01，P<0.05)；与OC+Tregs+CIA组比较，OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组OC分化数目和骨吸收陷窝面积显著减少(P<0.01)。

表2 OC-Tregs共培养体系内OC数量和骨陷窝吸收面积的变化

注：与OC+Tregs+Control组比较：*P<0.05，**P<0.01；与OC+Tregs+CIA组比较：##P<0.01

图1 OC-Tregs共培养体系中OC数量和骨吸收陷窝的变化(×100)注：a.OC+Tregs+Control组；b.OC+Tregs+CIA组；c.OC+Tregs+LEF组；d.OC+Tregs+YSJB组

3.2 益肾蠲痹丸对OC-Tregs共培养内IL-10 和HMGB1蛋白表达的影响

与OC+Tregs+Control组比较，OC+Tregs+CIA组、OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组Tregs分泌的IL-10含量显著降低(P<0.01)；与OC+Tregs+CIA组比较，OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组Tregs分泌的IL-10含量显著增加(P<0.01)。

表3显示，与OC+Tregs+Control组比较，OC+Tregs+CIA组、OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组破骨细胞分泌的HMGB1含量显著增加(P<0.01)；与OC+Tregs+CIA组比较，OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组破骨细胞分泌的HMGB1含量显著减少(P<0.01)。

3.3 益肾蠲痹丸对OC-Tregs共培养内IL-10 mRNA和HMGB1、RAGE mRNA表达的影响

与OC+Tregs+Control组比较，OC+Tregs+CIA组Tregs中IL-10 mRNA表达量显著降低(P<0.01)；与OC+Tregs+CIA组比较，OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组Tregs中IL-10 mRNA表达量显著增加(P<0.01)。

表3显示，与OC+Tregs+Control组比较，OC+Tregs+CIA组、OC+Tregs+YSJB组中破骨细胞HMGB1 mRNA表达量明显增加(P<0.01，P<0.05)，OC+Tregs+CIA组中破骨细胞RAGE mRNA表达量明显升高(P<0.05)；与OC+Tregs+CIA组比较，OC+Tregs+LEF组和OC+Tregs+YSJB组中破骨细胞HMGB1、RAGE mRNA表达量明显减少(P<0.01，P<0.05)。

表3 OC-Tregs共培养体系内IL-10、HMGB1、RAGE 表达的变化

注：与OC+Tregs+Control组比较：**P<0.01，*P<0.05；与OC+Tregs+CIA组比较：##P<0.01，#P<0.05

4 讨论

益肾蠲痹丸以熟地黄、淫羊藿、骨碎补补肝肾、扶正气；以乌梢蛇、白僵蚕、全蝎、露蜂房蠲痹通络，搜剔病邪，诸药相合、标本兼顾、扶正祛邪对痹症有较好的疗效[7-8]。实验研究也表明，益肾蠲痹丸能减轻CIA大鼠踝关节肿胀程度，显著抑制CIA大鼠组织病理改变，且对肾虚证和脾虚证CIA大鼠也有明显的疗效[9-11]。大鼠的病理学研究表明，益肾蠲痹丸能使滑膜组织炎症减轻，胶原纤维沉着减少，软骨细胞增生修复[12]。

RA是最常见的自身免疫性疾病，可以导致关节畸形及功能丧失，抑制RA患者关节局部破坏对于治疗RA有重要意义。研究表明，骨组织和免疫系统之间相互影响[13]。因此本课题组建立了OC-Tregs共培养体系，以期探讨骨与免疫系统之间的关系，并应用此培养体系探讨雷公藤甲素对该培养体系中OC分化的影响[4]。YSJB是临床治疗类风湿关节炎的常用中成药，研究表明该药对免疫系统有调节作用，因此本研究以该共培养体系为研究对象，探讨YSJB治疗RA 的作用机制。结果显示，OC+Tregs+CIA组OC数目和骨陷窝吸收面积显著高于OC+Tregs+Control组，而YSJB能明显抑制共培养体系中OC 的分化，减少OC的骨吸收。

有研究表明，Tregs调节作用部分依赖于IL-10抑制促炎因子生成[14]。HMGB1是RA中重要的促炎介质，血清HMGB1水平升高与更具破坏性的关节炎有关[15]；而且RAGE是HMGB1的受体， HMGB1的分泌增加和RAGE的表达增加能促进炎症的发展[16]。本实验结果表明，共培养体系Tregs IL-10分泌OC+Tregs+CIA组明显低于OC+Tregs+Control组，OC HMGB1、RAGE分泌和表达OC+Tregs+CIA组明显高于OC+Tregs+Control组；而OC+Tregs+YSJB组IL-10含量明显高于OC+Tregs+CIA组，HMGB1、RAGE表达明显低于OC+Tregs+CIA组，说明YSJB能促进共培养体系中Tregs对IL-10的分泌，抑制OC中HMGB1和RAGE的表达。

综上所述，益肾蠲痹丸能抑制OC-Tregs共培养体系中OC分化和骨吸收功能，其机制与促进Tregs IL-10的分泌，抑制OC HMGB1、RAGE表达有关，这可能是其治疗RA的作用机制之一。

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