回回药方圣世散对先兆流产小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3表达的影响❋

邓玉娥，杜小利，李 娜，苏 莉，张艳春

(宁夏医科大学， 银川 750004)

先兆流产是妇产科多发病之一，现代医学认为其病因多见免疫因素、遗传因素、内分泌因素、子宫解剖异常、感染因素等[1]。 目前，妊娠免疫耐受机理是国内外研究的热点。研究表明，在调节母胎界面免疫耐受中，Th1/Th2型细胞因子平衡是调节母胎免疫的关键,当正常妊娠母胎界面Th1/Th2平衡遭受破坏，Th1过度表达，将导致流产的发生[2]。细胞因子信号传导负调控因子SOCS1、SOCS3在胚胎期参与调节T细胞的分化调节Th1/Th2细胞因子的平衡，以维持正常妊娠[3]。

先兆流产属于中医学“胎漏”“胎动不安”等范畴，中医学认为先兆流产多因肾虚胎元失固引起。回回药方圣世散源于《回族医方集萃》[4]，原方由桑寄生、菟丝子、阿胶、白术、蕨麻、苎麻根、杜仲、续断8味中药组成，具有补肾安元、益气固脱之功。临床研究表明，圣世散可调节先兆流产患者血中HCG、E2及P水平，改善其黄体功能，保胎有效率达88.6%[5]。目前对圣世散发生药效的分子机制研究尚无报道，故动物实验通过检测先兆流产小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表达含量，从分子水平初步探讨圣世散保胎的免疫机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级6～8周龄18～22 g雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠24只，雄性BALB/C小鼠6只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供(动物许可证号SCXK(京)2014-0004)。

1.2 实验药物

圣世散饮片购自宁夏明德中药饮片有限公司，经宁夏医科大学附属回医中医医院中药房中药师鉴定合格。将8味药水煎回流浓缩至含生药量1 g/mL，4 ℃保存备用。

1.3 实验仪器与试剂

1.3.1 仪器 冰冻切片机、电热恒温培养箱、生物组织包埋机、OLYMPUS BX51- DP71研究级正置荧光显微镜。

1.3.2 试剂 SV0002-兔IgG两步法免疫组化试剂盒、兔多克隆抗体SOCS1、SOCS2、SOCS3、DAB显色试剂盒等。

2 方法

2.1 分组与造模

将雌性CBA/J小鼠48只与雄性DBA/2小鼠24只按2∶1的比例合笼随机分为先兆流产模型组和圣世散高、中、低剂量组，次日早晨取雌鼠检查阴道栓，以孕鼠阴道口用无菌小棉签探测到有血且体质量明显下降，而无妊娠物排出确定为先兆流产症状；将雌性CBA/J小鼠12只与雄性BALB/C小鼠6只按2∶1比例合笼建立正常妊娠组，同法观察记录受孕情况。

2.2 分组与给药

各组从妊娠第0天开始灌胃给药，圣世散低、中、高剂量组给药剂量分别为含生药量3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，正常妊娠组及先兆流产模型组给予相同体积蒸馏水，连续灌胃14 d。

2.3 标本采集与处理

2.3.1 计算各组孕鼠胎盘平均质量 孕鼠连续灌胃给药14 d，末次给药1 h后取胎盘组织计数并称总质量。胎盘平均质量=胎盘总质量÷胎盘个数，比较各组胎盘平均质量差异。

2.3.2 免疫组化染色 取孕鼠蜕膜和胎盘组织石蜡包埋，冰冻切片机切片(5.0 μm)、贴片，3%双氧水封闭10 min，5%BSA血清封闭30 min，加一抗(SOCS1、SOCS3、1∶250)过夜，加二抗(聚合HRP标记抗兔IgG)，DAB显色，苏木精复染、封片，光镜下观察、照相。

2.3.3 HE染色 取胎盘组织石蜡切片标本，5%伊红酒精染色,封片，光镜下观察，照相。

3 统计学方法

4 结果

4.1 一般情况

正常妊娠组小鼠精神状态佳，皮毛有光泽，未见阴道口流血现象。其他各组均出现不同程度精神状态欠佳、毛色干枯、活动力下降等症状，部分可见阴道口有血渍，先兆流产模型对照组表现尤为明显，各组均未见妊娠物排出。

4.2 5组孕鼠胎盘平均质量比较

表1显示，与正常妊娠组比较，先兆流产模型组的胚胎质量明显降低(P<0.05)；与先兆流产模型组比较，圣世散高、中剂量组孕鼠胎盘质量均增加(P<0.05)，圣世散低剂量组无明显变化(P>0.05)。

表1 各组孕鼠胎盘平均质量比较

注：Fa=5.254，Pa=0.002；与正常妊娠组比较：*P<0.05；与先兆流产模型组比较：#P<0.05

4.3 光镜观察结果(HE染色)

图1显示， 每组均放大400倍拍摄胎盘蜕膜组织。

图1 各组小鼠母胎界面HE染色结果(10×40)

4.4 免疫组化染色结果

4.4.1 免疫组化法 表2图2、3显示，检测圣世散对小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表达的影响。图2、3显示，5组小鼠母胎界面均可见SOCS1和SOCS3蛋白棕黄色阳性表达区域，主要位于细胞质内，细胞核蓝染，各组阳性表达强弱不等。

5 讨论

正常机体发挥免疫功能的细胞主要是T细胞，CD4+T细胞在接受抗原刺激后可分化为Th1和Th2型2个细胞亚群。Th1主要分泌IL-2(白介素-2)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)，介导细胞免疫反应并参与炎症反应和组织损伤；Th2主要分泌IL-4、IL-6，介导体液免疫反应，促进抗体形成并抑制免疫炎症发生，减少细胞过度损伤，抑制Th1型细胞的产生[6]。

表2 各组小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表达平均光密度值水平比较

注：Fa=41.551，Pa=0.000；Fb=18.327，Pb=0.000；与正常妊娠组比较：*P<0.05；与先兆流产模型组比较：#P<0.05

图2 各组小鼠母胎界面SOCS1免疫组化染色结果(10×40)

图3 各组小鼠母胎界面SOCS3免疫组化染色结果(10×40)

正常妊娠期胚胎蜕膜中，由Th1分泌的TNF-α可调节妊娠滋养细胞的生长分化，促进孕酮的分泌，有利于胎儿的生长发育。但过多的TNF-α可促进蜕膜和绒毛膜中前列腺素E2的合成及释放，导致子宫平滑肌收缩而发生流产[7]；由Th1分泌的IL-2在适量浓度时可发挥特异性免疫屏障的作用，但若IL-2异常上调则会损害胎盘组织[8]；由Th2分泌的IL-4可下调Th1细胞介导的免疫应答，IL-6可调节胎盘激素的合成及胚胎的着床，抑制母体排斥反应以维持妊娠[9]。由此得知，Th1/Th2细胞因子与自然流产有密切关系。

研究认为，人与小鼠免疫网络Th1/Th2细胞因子的调节主要是被 SOCS1、SOCS3 蛋白所控制[10]。Thl、Th2均可诱导SOCS1、SOCS3产生，而这2种蛋白反过来可抑制上述细胞因子的信号传导过程[11]。SOCS1主要表达在Th1细胞中，并通过抑制Th2细胞因子的信号传导通路而抑制其免疫反应；SOCS3蛋白则主要表达在Th2细胞中并通过抑制Th1细胞因子的信号传导通路而抑制其免疫反应，使T细胞的分化朝着有利于妊娠维持的Th2细胞分化[12]。由此看来，SOCS1、SOCS3对Thl/Th2平衡调节起关键作用。

现代药理学研究表明，补肾健脾中药有调节免疫-内分泌等多系统的功能，对先兆流产能起到综合治疗的作用[13]。回回药方圣世散具有补肾安元、益气固脱之功，为验证圣世散的临床疗效，杜小利[14]等选取70例患者，其中治疗组35例患者给予圣世散煎剂口服，临床保胎有效率88.6%。对照组35例口服维生素E、肌肉注射黄体酮，保胎有效率74.3%，结果表明圣世散治疗先兆流产优于西药对照组。

实验选取的CBA/J×DBA/2先兆流产动物模型，其受孕雌鼠CBA/J具有围着床期反复自然流产的特点，与人类反复自然流产发生时期相似[15]。赵爱民[16]等发现，CBA/J×DBA/2小鼠模型CBA/J孕鼠外周血Thl型细胞因子浓度显著高于正常妊娠组，而Th2则显著低于正常妊娠组，这表明CBA/J×DBA/2先兆流产小鼠模型是以Th1/Th2平衡失调为流产机理。

本实验从Th1/Th2平衡调控蛋白SOCS着手，更深层次地探讨圣世散的免疫调节机制。结果表明，正常妊娠组小鼠母胎界面SOCS1低表达，SOCS3

高表达；先兆流产模型组SOCS1表达明显升高，SOCS3明显下降；圣世散高、中剂量组SOCS1、SOCS3表达接近正常妊娠组，从而证实圣世散保胎机理可能是通过升高母胎界面SOCS3表达水平，降低SOCS1，促使T细胞的分化偏向于Th2型细胞因子，间接抑制Th1型细胞因子及其胎盘损害作用，维持Thl/Th2平衡而保护胚胎。

参考文献：

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[3] LINDEMANN C,HACKMANN O,DELIC S,et al. SOCS3 promoter methylation is mutually exclusive to EGFR amplification in gliomas and promotes glioma cell invasion through STAT3 and FAK activation[J]. Acta Neuropathol,2011，122(2):241-251.

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[16] 赵爱民，林其德．Th1和Th2型细胞因子与复发性流产的相关性[J]．上海第二医科大学学报，2000，20(S1)：16-18.