转甜瓜CmSAMDC基因拟南芥的获得及其耐盐性研究

刘长命，张 显，王永琦

(1 商洛学院，陕西商洛 726000；2 西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨陵 712100)

在植物生长发育过程中，盐胁迫已成为非生物胁迫中最为严重的不利因素之一，许多育种工作者都把提高作物的耐盐性作为重要的育种目标[1]。据不完全统计，全球有约10%的陆地面积被盐渍化，中国的盐渍土面积也已接近1×108hm2，且日趋严重。因此，深入开展植物耐盐性机理研究，对培育耐盐植物，改善生态环境具有非常重要的意义[2]。

多胺主要指腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)，是所有活体细胞含有的一种低分子脂肪胺类。因其具有的多聚阳离子特性，使它能与一些带负电荷的大分子如DNA和RNA、蛋白质、磷脂等相互作用，进而影响他们的活性和稳定性[3]。多胺代谢途径被研究者作为植物潜在抗性研究的目标，多胺合成相关基因与植物对环境胁迫的抗性关系也越来越受到关注，如在冷害[4]、盐胁迫[5]、病原菌侵染[6]时植物内源多胺的合成与代谢都发生了改变。并且相对于敏感品种，抗性品种在外界环境胁迫下通常能合成更多的多胺类物质来响应胁迫[7-9]。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)是Spd和Spm合成过程中的一个关键酶。研究表明，SAMDC基因涉及到众多植物对非生物胁迫和生物胁迫的抗性反应过程[10-11]。Walters等[12]通过对大麦施用外源茉莉酸甲酯，改变了大麦体内的多胺代谢水平，并诱导了其对白粉病的系统防卫反应。Wi等[13]研究表明，转康乃馨SAMDC基因的烟草植株内源多胺含量出现明显上升，同时增强了转基因烟草对外界胁迫的广谱抗性。

在作者前期的研究中[14]，已从抗病甜瓜品种‘云甜930’中克隆获得了SAMDC基因，命名为CmSAMDC(GenBank登录号为KF151861)。CmSAMDC蛋白有2个高度保守的结构域，与拟南芥(CAA69073.1)相似性达97%。为了进一步研究该蛋白的功能，本研究构建了35S∷CmSAMDC植物过表达载体，采用农杆菌介导法转化拟南芥，并对过表达植株的耐盐性进行分析，以期为利用该基因进行植物耐盐性改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料及菌株

供试拟南芥为哥伦比亚野生型，拟南芥种子经消毒和清洗干净后，用0.05%琼脂均匀铺于MS培养基上，封口，4 ℃暗中春化2 d后置于人工气候箱内培养，温度22℃/20 ℃ (昼/夜)、光照16 h/8 h(光/暗)，约2周后移至8 cm盆内继续培养。实验中用到的大肠杆菌菌株DH5α，农杆菌菌株GV3101，植物表达载体pCAMBIA1304均由本实验室保存。

1.2 方 法

1.2.1过表达载体的构建及拟南芥转化将克隆获得CmSAMDC基因的ORF构建到过表达载体pCAMBIA1304上，两端引入SacI和SpeI酶切位点，引物序列见表1。对CmSAMDC基因编码序列和载体p1304分别双酶切后连接过夜，构建p1304-CmSAMDC过表达载体，转化农杆菌后参考Clough等[15]的方法转化拟南芥。T0代种子用50 mg/L浓度潮霉素(Hyg)进行抗性筛选，之后降至30 mg/L浓度筛选至T3代。

表1 引物序列

1.2.2转基因植株SAMDC基因表达分析对6周龄的T3代转基因株系TA1和TB1的CmSAMDC基因和拟南芥的SAMDC基因家族进行半定量和实时定量分析，引物序列见表1。半定量反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72 ℃ 10 min。实时定量反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20s，40个循环，以拟南芥Actin2基因作为内参，3次重复。

1.2.3转基因植株耐盐性鉴定将T3代转基因植株和野生型拟南芥的种子播于含不同浓度NaCl(0、100、150、200、300 mmol/L)的MS培养基上观察发芽情况。将MS培养基上生长15 d的幼苗一部分移至上述浓度NaCl培养基上观察其对盐胁迫的抗性，一部分移栽入盆培养至4周龄再分别浇灌200 mmol/L或400 mmol/L NaCl溶液，每穴浇灌15 mL，每2 d 1次，于盐胁迫后第12天参照Sunkar等[16]的方法测定脂质过氧化水平(MDA)。

1.2.4转基因拟南芥叶绿素含量测定精确称取0.05 g新鲜叶片，去主脉后剪碎，加入80%丙酮5 mL避光浸提24 h，测定663、645和470 nm吸光值，计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素的含量。

2 结果与分析

2.1 CmSAMDC基因序列分析

作者前期克隆获得了CmSAMDC基因的ORF序列，全长1 095 bp(图1)。序列分析表明编码364个氨基酸，分子量40 kD，等电点4.61，含酶原剪切位点和PEST 2个保守结构域，其氨基酸序列与拟南芥(CAA69073.1)相似性达97%(图2)。

2.2 CmSAMDC基因植物过表达载体的构建、转化及抗性筛选

为了验证CmSAMDC基因在植物体内的功能，根据p1304载体和基因的序列特征，构建了植物

过表达载体，命名为35S∷CmSAMDC，其T-DNA区示意图如图3，A所示。将构建好的过表达载体以农杆菌浸染的方法转化拟南芥，潮霉素(Hyg)抗性筛选发现，野生型拟南芥种子在萌发后不久(约7 d)逐渐死亡，而转基因种子可以正常生长(图3，B1)。通过目的基因的PCR检测，获得了4个转基因株系(图3，B2)，其中TA1和TA2株系基因表达量最高，生长正常(图3，B3)。

2.3 转基因植株的形态特征与光合色素含量

形态学观察发现，T3转基因株系TA1和TB1株高在播种后4周明显高于野生型(WT)拟南芥，平均株高达28 cm，而WT平均株高18 cm，且转基因植株抽薹更多(图4，A)，叶片颜色也更深(图4，B)。对叶片光合色素含量测定表明(图4，C)，转基因植株的叶绿素a(Ca)、叶绿素b(Cb)、总叶绿素(Ct)及类胡萝卜素(Cx.c)含量均显著高于野生型植株。

2.4 CmSAMDC基因的表达分析

通过对转基因植株的筛选，选取TA1和TB1株系进行CmSAMDC基因定量和半定量表达分析。结果发现甜瓜CmSAMDC基因在TA1和TB1中成功表达(图5，A、B)。

M. DL2000; 1.CmSAMDC扩增产物图1 甜瓜CmSAMDC基因PCR扩增产物M. DL2000; 1. PCR products of CmSAMDC geneFig.1 PCR products of CmSAMDC gene in melon

图2 部分植物SAMDC氨基酸进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of the SAMDC amino acid sequences of some species

A. 植物超表达载体T-DNA区示意图; B1为WT和T3植株在含潮霉素培养基上生长7 d, B2和B3分别为T3植株播种后20 d和45 d;WT. 野生型拟南芥; T3. 转CmSAMDC基因植株图3 过表达CmSAMDC基因拟南芥的生长情况A. Schematic representation of T-DNA regions of 35S∷CmSAMDC; B1 indicates the growth of WT and T3 Arabidopsis lines on MS medium with hygromycin after seven days, B2 and B3 indicate the growth of T3 Arabidopsis lines after 20 days and 45 days respectively; WT. Wild type of Arabidopsis; T3. The transgenic Arabidopsis with CmSAMDC geneFig.3 Growth of transgenic Arabidopsis lines over-expressing CmSAMDC gene

A、B.野生型(WT)拟南芥和转CmSAMDC基因植株(TA1、TB1)的株高和叶色; C. 拟南芥各株系的光合色素含量比较;Ca.叶绿素a; Cb.叶绿素b; Ct.总叶绿素; Cx.c.类胡萝卜素; **表示差异极显著(P<0.01),下同图4 拟南芥野生型(WT)和转CmSAMDC基因(T3)植株的表型比较A, B. The height and leaf color in wild type and transgenic Arabidopsis lines; C. The comparison of photosynthetic pigment contents in different Arabidopsis lines: Ca. Chlorophyll a; Cb. Chlorophyll b; Ct. Chlorophyll a+b; Cx.c. Carotenoids; ** indicate significant differences among samples at 0.01 level. The same as belowFig.4 The comparison of phenotypic characteristics between wild type and transgenic Arabidopsis

对转基因拟南芥植株的SAMDC基因家族表达分析发现，除AbSAMDC2 外，其他家族成员AbSAMDC、AbSAMDC3、AbSAMDC4在不同植株中均有不同程度表达(图6)。这一结果表明，异源CmSAMDC的表达没有明显导致拟南芥中该同源基因的抑制表达。

2.5 转CmSAMDC基因拟南芥的耐盐性分析

对转基因T3代株系TA1、TB1和WT植株在不同浓度NaCl胁迫下的种子发芽率进行观察，结果显示，在不含NaCl的MS培养基上，WT植株和转基因T3植株的生长情况相似(图7，A)；而在含150 mmol/L盐培养基上，转基因T3代的种子发芽较WT种子迟约1 d (图7，B)，但随后生长势却强于野生型植株(图7，C)。同时，对根系观察也发现，转基因T3植株在100、150、200 mmol/L浓度盐胁迫下侧根较WT植株更为发达(图7，D)。

将MS培养基上生长15 d的幼苗移栽至穴盘中，缓苗3 d后，隔日浇1次NaCl溶液。在200 mmol/L NaCl处理8 d后，转基因T3代植株TA1和TB1未表现盐害症状或者症状较轻，但WT植株叶片出现轻微黄化；在400 mmol/L NaCl处理8 d后，转基因植株生长受阻，但仍能继续维持生长，而WT植株生长严重受阻并黄化；浇水对照组WT和T3代植株的长势基本一致(CK)(图8，A)。在200 mmol/L NaCl胁迫16 d后，WT植株株型明显小于TA1和TB1；400 mmol/L NaCl胁迫16 d后，TA1和TB1生长受阻较重，而WT植株已经死亡(图8，B)。对盐胁迫12 d的植株叶片测定脂质过氧化程度(MDA)显示(图8，C)，WT植株在200和400 mmol/L NaCl胁迫下，MDA 水平分别上升了92.%和376%，TA1、TB1植株的MDA上升程度约为WT植株的一半，各自上升了49.9%、196%和27.5%、149.5%。

图6 拟南芥SAMDC基因在不同植株中的表达Fig.6 The SAMDC gene expressed in different A. thaliana lines

TA1和TB1为转基因拟南芥; WT1为野生型拟南芥; 下同图5 CmSAMDC基因在拟南芥中表达的半定量(A)和实时定量(B)分析TA1 and TB1 indicate transgenic Arabidopsis lines; WT1 indicates wild type Arabidopsis line; the same as belowFig.5 Semi-quantitative PCR(A) and Real-time qRT-PCR(B) analyses of the CmSAMDC gene expressed in Arabidopsis lines

A. 播种后3 d; B. 播种后7 d; C.移植后7 d; D. 移植后15 d 图7 不同浓度盐胁迫对WT和转基因拟南芥的影响A. 3 days after sowing; B. 7 days after sowing; C. 7 days after transplantation; D. 15 day after transplantationFig.7 The influence of different concentrations of salt on WT and transgenic T3 plants

A. 盐处理后8 d; B.盐处理后16 d; C. 盐处理后12 d图8 不同盐浓度灌根对WT和转基因拟南芥的影响A. 8 days after salt treatment; B. 16 days after salt treatment; C. 12 days after salt treatmentFig.8 The influence of different salt concentrations on WT and transgenic T3 plants by root irrigation

3 讨 论

SAMDC是Spd和Spm合成的关键基因，它催化Put转化为Spd和Spm。目前，一些植物的SAMDC基因如甜瓜[17]、甘蔗[18]、番茄[19]等已被鉴定，且该基因在不同植物中序列相似性较高，保守性强，推测与其在植物生长发育和响应胁迫中的重要作用相关。有研究表明[7,20]，SAMDC基因涉及到多种非生物胁迫的抗性反应中，如高温、冷害及盐胁迫等，且抗性品种较敏感品种的表达水平更高。研究还表明[13,19]，一些转SAMDC基因的植物表现出了对外界胁迫的广谱抗性。在本研究中，转CmSAMDC基因拟南芥植株较野生型植株表现出更强的耐盐性，150和200 mmol/L促进了转基因植株侧根的生长，并且转基因植株幼苗在含150 mmol/L NaCl培养基上生长较野生型更快。对4周龄幼苗浇灌200和400 mmol/L NaCl溶液也表现出了转基因植株耐盐性更强的特征。但是，种子萌发情况却不尽相同，表现为150 mmol/L盐溶液延迟了转基因植株种子的萌发时间，子叶长出时间较野生型植株晚约1 d，推测转基因植株种子萌发时间的延迟可能与其种子千粒重减小，营养物质储存少有关。

在植物受到胁迫后，多胺对促进细胞分裂、诱导细胞凋亡、次生代谢调控及信号转导等起着重要的作用[21]。本研究发现，转CmSAMDC基因拟南芥植株表现出了对盐胁迫的抗性，但转基因株系的激素含量变化与其异源CmSAMDC基因的表达量并无一致对应关系，推测多胺通过某种调控机制或者与某些激素共同参与了抗性反应过程。不过，从作者前期的研究来看[14,22-23]，在对不同抗性甜瓜接种白粉病菌后，抗病甜瓜品种的Put、Spd和Spm含量均较感病品种要高，抗氧化酶活性也更高，本研究还发现转基因拟南芥植株的脂质过氧化程度(MDA)较野生型也更低。说明甜瓜抗病品种和转CmSAMDC基因拟南芥植株在受到外界胁迫时，能通过协调各种活性氧清除系统以清除过多的活性氧积累，减少由其带来的伤害，更好地维持植物活性氧水平的代谢平衡[24-25]，而这一调控过程涉及了多胺类物质的参与。在下一步的研究中，将进一步鉴定由多胺直接或间接调控，并具有防御逆境胁迫作用的潜在基因和抗性物质。