氧化应激时PeroxiredoxinⅡ膜质转移对红细胞渗透脆性的影响

于佳斌,卢 悦,张津松,韩英浩

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,中国黑龙江大庆163319)

机体正常新陈代谢会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),由于机体存在抗氧化机制,氧化-还原系统相对平衡,因此产生的ROS并不会影响机体功能[1,2]。当机体受到多种有害刺激,体内产生过多的ROS不能得到及时清除时,会引起氧化-还原系统失衡,ROS过度累积可导致机体处于氧化应激状态[3～5]。红细胞是血液系统中最丰富、最重要的血细胞之一,由于机体时刻都处于运输氧的过程,在此过程中氧合血红蛋白的2价铁离子失去1个电子变成3价的高铁血红蛋白,并产生1个超氧阴离子,从而使红细胞处于氧化环境[6]。红细胞中存在抗氧化系统,可以保证其在氧化环境中正常行使功能,而一旦抗氧化系统出现问题,细胞膜蛋白就容易因受到ROS攻击而受损,进一步影响红细胞渗透脆性等生理功能。膜蛋白具有维持细胞骨架正常功能和膜结构稳定性的重要作用,红细胞的渗透脆性是体现红细胞抗压能力的重要指标[7],渗透脆性的改变是红细胞形态、结构出现异常的集中表现[8,9],临床用红细胞渗透脆性来作为溶血性贫血等血液疾病的初步诊断指标,可间接反映细胞膜有无异常。红细胞膜是双层磷脂结构,其间镶嵌着多种膜蛋白,根据膜蛋白功能的不同,可将其分为整合蛋白、骨架蛋白、锚定蛋白。红细胞特有的柔韧性和变形性源自其本身的膜蛋白和细胞骨架的特点。带3蛋白(band 3)是整合蛋白的代表性蛋白质,与红细胞膜结构的稳定、变形能力有紧密的联系[10,11];血影蛋白(spectrin)是一种细胞骨架蛋白,对维持细胞骨架的稳定、结构、功能起着重要作用[12]。Band 3和spectrin作为最重要的整合蛋白和细胞膜骨架蛋白,在维持红细胞的正常形态、变形性、骨架蛋白功能中起着不可或缺的作用。当机体处于氧化应激状态时,抗氧化系统出现问题的红细胞极易受到影响,出现渗透脆性增加、band 3和spectrin等关键膜蛋白从红细胞膜上降解、骨架蛋白功能受损等现象,导致红细胞稳定性降低,增加血液疾病发生的风险[13]。

Peroxiredoxins(Prxs)是一类抗氧化蛋白质,可以保护细胞免受氧化应激损伤[4,14]。Prxs家族有6个成员,分别是PrxⅠ～PrxⅥ,它们广泛分布于哺乳动物细胞内[15]。有研究显示其6个成员中,仅PrxⅡ在细胞膜上表达[16],并且PrxⅡ基因敲除鼠出现溶血性贫血的表型[17]。PrxⅡ作为红细胞中除血红蛋白和碳酸酐酶外含量最为丰富的蛋白质,具有保护红细胞免受氧自由基损害的生理功能[18]。

本研究通过比较PrxⅠ、PrxⅡ在红细胞中的表达含量,利用Western-blot、渗透脆性实验等方法对氧化应激时红细胞的渗透脆性、PrxⅡ蛋白的膜质转移、膜稳定蛋白、骨架蛋白的相应变化进行检测,探究了氧化应激时PrxⅡ的膜质转移与红细胞渗透脆性之间的关系,为溶血性贫血的预防和治疗提供了理论基础和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

重组PrxⅠ、PrxⅡ蛋白 (上海经科化学科技有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2,美国Hy-Clone 公司);3%(V/V)H2O2、Tris、过硫酸铵、甲叉双丙烯酰胺(Sigma公司,美国);硫脲、尿素、Chaps(北京博奥拓达科技有限公司);抗PrxⅠ第一抗体、抗PrxⅡ第一抗体、抗band 3第一抗体、抗spectrin第一抗体、抗β-actin第一抗体、鼠源第二抗体、兔源第二抗体(Santa公司,美国);生理盐水(吉林省都邦药业股份有限公司);Bradford蛋白质定量试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器设备

Infinite M200pro酶标仪购自帝肯(上海)贸易有限公司;垂直板电泳槽购自通用电气医疗系统贸易发展(上海)有限公司;稳压稳流电泳仪购自上海天能仪器厂;小型台式冷冻离心机为美国Sigma公司产品;化学免疫荧光成像系统为美国GE公司产品;抗凝管购自三力有限公司。

1.3 实验动物

129/SvJ野生型8周龄小鼠,由黑龙江八一农垦大学疾病模式动物研究中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠眼眶取血

取周龄为8周的129/SvJ野生型小鼠进行眼眶静脉丛取血。采血者的左手拇指和食指从小鼠背部握住小鼠颈部,使其头部固定,拇指和食指压迫小鼠颈部两侧,使右侧眼球突出,眼眶后侧静脉丛充血,此时将毛细管以45°夹角旋转刺入小鼠眼眶后侧,插入深度2～3 mm,取血同时放松手指,使血液顺利流进抗凝管,取血200 μL[19]。

1.4.2 H2O2浓度选择及配制

大量研究表明,过多的氧自由基可引发红细胞过氧化,导致红细胞氧化损伤[20～22]。过氧化氢(H2O2)是活性氧的一种,体外实验中,H2O2是制造红细胞氧化损伤的理想试剂,根据文献报道,H2O2诱导氧化损伤模型浓度一般控制在100～500 μmol/L之间,其中选用200 μmol/L较为广泛[23,24],所以本文中选用200 μmol/L H2O2处理红细胞30 min诱导红细胞的氧化损伤。

将2 μL 3%H2O2加到8.8 mL生理盐水中,配制成终浓度为200 μmol/L的H2O2溶液。

1.4.3 渗透脆性实验

梯度稀释法制备不同浓度的生理盐水[25]。实验分为对照组与实验组,取8周龄129/SvJ野生型小鼠抗凝血液100 μL加入1.5 mL离心管中,1 467 g离心10 min,将上层透明的淡黄色血浆吸出弃去,加入1 mL 0.9%生理盐水,1 467 g离心10 min,洗涤2～3次,至上清澄清,对照组取20 μL红细胞加入1 mL 0.9%生理盐水中,实验组取20 μL红细胞加入1 mL 200 μmol/L H2O2溶液中,制成2%的红细胞悬液,处理30 min,再从2%的红细胞悬液中各取20 μL放入200 μL各浓度的NaCl溶液中,轻摇混匀,1 467 g离心5 min,取上清150 μL加到96孔板中,酶标仪测定A540nm值,计算溶血率[26]。

1.4.4 红细胞膜和细胞质制备

取8周龄129/SvJ野生型小鼠抗凝血液400 μL加入1.5 mL离心管中,1 467 g离心5 min,将上层透明的淡黄色血浆吸出弃去,加入1 mL磷酸盐缓冲液,1 467 g离心5 min,去上清,洗涤2～3次。将红细胞平均分为两组,对照组加入1 mL磷酸盐缓冲液,实验组加入1 mL 200 μmol/L H2O2,处理30 min,处理后1 467 g离心5 min,洗涤1次,加入1 mL PB(phosphate buffer,pH=8.0)溶液,8 802 g离心10 min,分离上清及沉淀。上清液含有细胞质,留下备用;沉淀反复洗涤5～8次,至上清不再浑浊,弃上清,留细胞膜备用[27,28]。

1.4.5 Bradford法测定标准曲线

参照Bradford蛋白质定量试剂盒,分别取重组PrxⅠ、PrxⅡ蛋白质标准品按不同浓度稀释,加入1 mL考马斯亮蓝,混匀,用分光光度计测定595 nm处的吸光值,记录数值,绘制标准曲线。

1.4.6 蛋白质免疫印迹分析

正常饲养129/SvJ野生型小鼠至8周龄,小鼠眼眶取血液200 μL,抗凝,分为实验组与对照组。实验组为H2O2处理的红细胞,对照组为正常红细胞,利用方法1.4.4制备两组细胞膜以及细胞质,取实验组与对照组细胞膜、细胞质各100 μL,加入 20 μL 裂解液以及 30 μL 5× buffer,混匀,100℃变性5 min,进行10%SDS-PAGE电泳,每孔加入变性蛋白质15 μL,电泳后电转移至NC膜上,室温封闭1 h,红细胞总蛋白质按1∶1 000比例孵育Prx I、PrxⅡ蛋白质一抗;细胞膜蛋白质按 1∶1 000比例孵育 PrxⅡ、band 3、spectrin蛋白质一抗;细胞质蛋白质按1∶1 000比例孵育PrxⅡ蛋白质一抗,4℃过夜,加入1∶2 000的相应二抗稀释液,室温孵育2 h,ECL发光显影,使用TINA20分析结果[18,29]。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 PrxⅠ和PrxⅡ在红细胞中的表达水平

为比较PrxⅠ与PrxⅡ在红细胞中表达水平,取3只129/SvJ野生型小鼠红细胞,利用West ern-blot检测红细胞中PrxⅠ和PrxⅡ总蛋白质含量,根据不同浓度重组PrxⅠ、PrxⅡ蛋白标准品绘制的标准曲线(PrxⅠ：y=0.000 05*OD+0.882 16;PrxⅡ：y=0.001 30*OD-5.861 23)计算红细胞总蛋白质中PrxⅠ、PrxⅡ含量(图1),结果显示,PrxⅡ在红细胞中的含量远高于PrxⅠ,差异极显著(P＜0.01)。

2.2 氧化应激对红细胞渗透脆性的影响

为检测氧化应激对红细胞渗透脆性的影响,将实验分为对照组和实验组,每组各9只小鼠。对照组将红细胞加入生理盐水中,实验组将红细胞加入H2O2溶液中,孵育30 min,随后将孵育的红细胞分别加入不同浓度的生理盐水,540 nm检测溶液吸光值。结果显示,与对照组相比,生理盐水浓度为0.32%～0.52%时,实验组红细胞渗透脆性明显增加且差异显著 (*：P＜0.05,**：P＜0.01,图2),表明氧化应激可引起红细胞渗透脆性升高。

2.3 氧化应激时红细胞中PrxⅡ的膜质转移

为了进一步探究氧化应激时红细胞渗透脆性增加与PrxⅡ之间的关系,分别提取实验组与对照组红细胞膜和细胞质蛋白质,利用Westernblot检测氧化应激时红细胞膜与细胞质中PrxⅡ含量的变化。结果如图3所示,与对照组相比,H2O2处理后,PrxⅡ在红细胞膜上的含量显著降低(P＜0.01),在细胞质中的含量显著增加(P＜0.001)。结果表明,氧化应激导致红细胞膜上PrxⅡ转移到细胞质中,显示氧化应激时红细胞渗透脆性的改变与PrxⅡ的膜质转移存在相关性。

2.4 氧化应激时红细胞膜蛋白band 3和骨架蛋白spectrin的含量变化

为了进一步检测氧化应激时红细胞膜稳定性蛋白质和骨架蛋白的变化,利用Western-blot检测维持膜稳定相关蛋白质band 3和保证细胞骨架正常行使功能相关蛋白质spectrin的含量,结果如图4所示,与对照组相比,band 3和spectrin在200 μmol/L H2O2处理30 min后表达量显著降低(P＜0.001)。结果显示,H2O2处理红细胞后,伴随着PrxⅡ的膜质转移,与膜稳定性和细胞骨架功能正常行使关联紧密的蛋白质含量在细胞膜上明显降低,表明氧化应激时PrxⅡ膜质转移影响了膜稳定性相关蛋白质band 3、细胞骨架蛋白spectrin在膜上的表达含量。

图1 PrxⅠ和PrxⅡ在红细胞中的表达水平Fig.1 The expression levels of Prxs in normal RBCs

图2 H2O2处理后红细胞渗透脆性的变化Fig.2 The change of osmotic fragility of red blood cells after H2O2treatment

3 讨论

图3 H2O2处理后红细胞中PrxⅡ膜质转移的Westernblot检测结果Fig.3 The expression of PrxⅡin erythrocyte membrane and cytosol after H2O2treatment

图4 H2O2处理后红细胞膜蛋白的变化Fig.4 The change of erythrocyte membrane proteins after H2O2treatment

在红细胞中,PrxⅡ以二聚体、十聚体和十二面球体的结构形式存在[30,31]。当红细胞处于氧化应激状态时,PrxⅡ蛋白之间通过二硫键形成二聚体,进一步超氧化可以形成十聚体及十二面球体,从而具备与其他蛋白质结合的能力[15]。有研究揭示十聚体的PrxⅡ可与血红蛋白结合保护血红蛋白在氧化应激时结构的稳定,表现出分子伴侣的特性[18]。PrxⅡ广泛分布于细胞质基质和细胞膜,虽然目前尚未明确PrxⅡ是以何种结构定位在细胞膜上,但是PrxⅡ在氧化应激时多种结构形式的转变与PrxⅡ的位置分布及其与相关蛋白质的结合能力关系密切[32]。本研究结果发现当红细胞处于氧化应激状态时,PrxⅡ从红细胞膜上转移到细胞质中,同时在生理盐水浓度为0.32%～0.52%时,红细胞渗透脆性显著增加,表明PrxⅡ在红细胞膜上的表达对于红细胞氧化应激时保护细胞膜免受损伤具有重要的作用。下一步通过研究PrxⅡ如何定位于细胞膜上,并且以何种结构与细胞膜上的蛋白质进行结合,对明确PrxⅡ保护红细胞膜及氧化应激时膜质之间的转移机制具有重要的意义。

ROS作为生物体新陈代谢产物,不仅可以破坏血红蛋白的结构,而且能对红细胞膜造成不可逆的损伤。Prxs是一类具有清除细胞内ROS能力的蛋白质[15]。其家族成员PrxⅡ在红细胞内的含量仅次于血红蛋白和碳酸酐酶的含量,且具有清除红细胞内多余ROS的作用,因此,PrxⅡ在红细胞膜上的表达在氧化应激时对于稳定膜蛋白的结构和功能、保护红细胞膜免受氧化损伤具有重要意义。据文献报道,PrxⅡ对红细胞具有非常重要的保护作用,但PrxⅡ如何保护红细胞膜免受氧化应激的影响却鲜见报道,本研究发现,氧化应激导致红细胞渗透脆性增加时PrxⅡ从细胞膜大量转移至细胞质中,而且维持膜稳定的band 3和细胞骨架蛋白spectrin显著减少,由此可推测,氧化应激时PrxⅡ从细胞膜上转移到细胞质中,使维持膜稳定的相关蛋白质band 3和保证细胞骨架正常行使功能的相关蛋白质spectrin受到活性氧的攻击而降解,最终导致了红细胞渗透脆性增加。PrxⅡ氧化应激时膜质转移的特性可以为溶血性贫血的治疗提供理论基础和相关药物靶点。